牛冷冻精液人工授精技术
一、牛冷冻精液人工授精站（点）的设置
1.在母牛数量较多而且集中的嘎查村或牧铺，要设离人工授精站（点）。每个人工授精站（点）配备1名技术成熟的配种员，负责运取牛冷冻精液及给母牛输精配种。
2.人工授精站（点）必须有专门的操作室，面积不少于（3×3）米2。室内要清洁卫生，干燥，阳光充足。要配备显微镜、天平、输精器、工作服、靴、乳胶（或塑料薄膜）手套、雨衣、水盆、毛巾等器具。
二、液氮的特性及液氮罐的使用方法
1.液氮的特性
（1）超低温性：液氮以空气为原料，通过液氮机降温冷却，加压变为液体，温度可达-196°C。
（2）液氮的物理特性：液氮无色、无味、无毒。
（3）渗透性：液氮的渗透性弱。
（4）室息性：在密闭的室内如有大量的液氮气化，将有窒息的危险。因此，冷冻精液的贮存室要有良好的通风条件。
2.液氮罐的使用方法
（1）对各种型号的液氮罐在使用前应查阅包装箱中的使用说明书，熟悉使用方法。一般在存放精液前24小时，至少6小时前注入液氮进行预冷，检查液氮损耗情况，确认保温性能正常时，方可装入冷冻精液。
（2）液氮罐不允许盛装其他液化气体。
（3）灌充和取出液氮时，要戴上安全眼镜和宽松易于摘下的手套，穿上胶靴，靴筒放在裤腿里，倒时要缓缓进行，尽量避免其飞溅或溢出。
（4）要定期检查颈塞的颈塞小沟，除去颈塞上的结冰，颈塞不得用其他物品代替。
（5）及时补充液氮。当罐内液氮面低于液氮罐内高度的三分之一时，即应补充液氮。如发现液氮消耗速度过快，或罐的颈口周围附有水珠，或出现白霜时，即表示液氮罐的保温性能下降，应将此罐内冻精转移到其它罐内。
（6）液氮罐要放在干燥、通风良好的屋内，下面垫上木板，离地面20—30厘米。不要放在工作室、寝室内。
（7）液氮罐的内腔每年要清洗一次，用中性洗衣粉做清洗剂，清洗液的温度不宜超过40℃，以防止影响罐的性能，缩短使用寿命。
三、牛冷冻精液的贮存、运输
1.牛冷冻精液的贮存
（1）根据液氮罐保温性能的要求，定期添加液氮，罐内要有盛装贮冻精的纱布袋或提漏，不得暴露在液氮面外。罐内液氮面高度不低于内壁高的三分之一。
（2）从罐内取出冻精时，纱布袋或提漏不得提出液氮罐口外，可将提漏置于罐颈下部，用长柄镊夹取冻精。取出冻精后应及时加盖，防止异物进入罐内和减少液氮挥发。
（3）将冻精从一个罐移向另一罐时，动作越快越好，纱布袋或提漏在空气中暴露的时间不得超过3—5秒钟。否则，会严重影响冻精的质量。
2.牛冷冻精液的运输
（1）冷冻精液的运输。冷冻精液贮存在液氮罐中，可以用飞机、火车、汽车、蓄力车和人力车运输。运输过程中尽量避免剧烈振动和碰撞，严禁横倒，在短时间内运输少量冻精，可以用暖水瓶盛装液氮，将冻精放在瓶内，取精人员随身携带。装液氮用的暖水瓶盖必须做有排气孔，否则容易爆破。
（2）解冻后精液的运输。冻精解冻后应在两小时内使用。如需运输，需严格包装，温度控制在10℃以下。一般可用凉毛巾包好，放入经预冷的暖水瓶中。
四、牛冷冻精液的剂型、剂量及解冻
1.牛冷冻精液的剂型
牛冷冻精液的剂型（即包装方法）有三种：颗粒法、安瓶法和细管法。目前生产上使用较多的细管冷冻精液，颗粒冷冻精液的使用量在逐年减少。颗粒冷冻精液的优点是易于制作，体积小，便于贮存运输。缺点是易受污染，不便标记。细管冻精的优点是不易污染，便于标记，适于机械化生产，解冻、输精方便，不足之处是生产成本高，需要成套设备。
2.牛冷冻精液剂量 我国目前使用的牛冷冻精液剂量分别为：细管冻精0.5毫升和0.25毫升，颗粒冻精0.1毫升。目前我市主要使用的是0.25毫升细管冻精。
3.牛冷冻精液的解冻
（1）牛颗粒冷冻精液的解冻
将一毫升解冻液注入灭菌的试管中，放入40℃温水杯内，当解冻液达40℃时，以事先预冷过的长柄镊子迅速取出一粒冻精，立即投入试管中轻轻摇动，当精粒融化2/3时，马上从温水杯中提出，抽入输精器中输精。
颗粒冷冻精液的质量要求及其活力检查。
a.剂量：每粒0.1±0.01毫升
b.活力：解冻后直线前进运动精子数不低于35%。
c.每粒含有直线前进运动精子数不少于1200万个。
冻精使用前应检查其活力，方法：以2.9%柠檬酸钠液0.1毫升，加温至35—40℃，投放冷冻精液一粒，轻轻地摇动，使之迅速融化。
用滴管吸取解冻后的精液，在清洁的载玻片上滴0.04—0.05毫升，然后加盖玻片，放在显微镜下尽快观察，观察精子的适宜倍数150—450倍，或采用高低倍相结合的方法进行综合评定。检查活力应在显微镜保温箱中进行，温度要求38—40℃。
（2）牛细管冷冻精液的解冻将细管冻精从液氮罐中取出，使带棉塞的一端朝下，立即投入38±2℃温水中边化边摇荡。化冻时间：0.5毫升和0.25毫升细管冻精分别为15—20秒和1—15秒。解冻时，细管朝上的一端不能正对着人，以免细管炸裂伤人。
解冻后，将封口的一端垂直剪掉一小段，装入细管输精器（凯苏枪）待用。
活力及有效精子数的检查方法与颗粒冻精相同。细管冻精每只有效精子数要求不少于1000万个。
五、与配母牛的组群、清群
1.开展牛冷冻精液人工授精的地区，要专门组织配种母牛群（简称“组群”，下同）。一般每群以百头左右为宜，如母牛数量较少而且分散的地区，可因地制宜适当组群。各群均按30—50头母牛配备一头结扎输精管的试情公牛。
2.在每年的四月中旬前要完成清群工作，即除选留的试情公牛外，其他小公牛全部去势、异地放牧或单独饲养，在整个配种季节不得进入冷配母牛群。同时对体小，失去繁殖能力和不够繁殖年龄的母牛应另外组群。
清群组群工作需苏木乡镇和嘎查村主要领导负责，畜牧技术人员密切配合方可顺利完成。
3.对配种母牛群要加强管理，做到专人、专群、专棚圈。在整个配种季节不能散群、不能混群。放牧员要跟群放牧，掌握好母牛发情时间，与配种员密切配合，及时报告发情母牛状况，保证发情母牛不漏配，适时输精受胎。
六、母牛的发情鉴定、适时输精及输精方法
（一）发情鉴定
牛的发情鉴定方法大致有以下三种：
1.外观鉴别：母牛发情一般表现为站立不安、鸣叫、张望、食欲减退、弓腰举尾、尿频、外阴部湿润、肿胀、有透明粘液流出、阴道粘膜潮红或爬跨其他牛。利用试情公牛来鉴别发情母牛，如母牛愿意接受试情公牛或其他母牛爬跨，即可判定为发情。
2.直肠检查：直检卵巢时，滤泡突出卵巢表面，有玉米粒大或樱桃大，触摸时发软，有明显液体感。触诊子宫时，子宫常有强烈迅速的收缩反应，有弹性坚实的感觉。
3.粘液检查：将子宫颈的粘液取出，涂片，显微镜下观察，处于发情的母牛，粘液呈羊齿状或树枝状花纹结晶。
（二）适时输精
母牛正常排卵时间是在发情结束后14小时以内，所以输精时间，掌握在发情的中期至末期阶段比较适宜。一般的做法是午前发现母牛发情，可在晚上或第二天上午输精；母牛午后发情，可在翌日早晨或翌日下午输精。在保证精液品质良好和发情鉴定准确的条件下，可以一次输精成功。为了可靠起见，应以两次输精为宜，间隔8—10小时。
（三）输精方法
在输精前要用蒸煮锅将缓冲液、蒸馏水、棉球、输精器、毛巾等器械进行消毒（具体消毒方法，见人工授精器械消毒部分）。用经过消毒的缓冲液冲洗输精器两次，然后抽取解冻后的精液。将母牛牵到输精架内保定好，把尾巴系于一侧，外阴部用清水洗净，用经过消毒的毛巾擦干，然后输精。握颈输精法：术者着胶皮围裙、胶鞋，左手戴长臂乳胶或塑料薄膜手套。术者左臂用水或肥皂沾湿，深入母牛直肠排出宿粪。并以手臂压按外阴部，迫使阴门开张。右手持输精器由阴门插入，先向上斜插，避开尿道口，而后再平插直至子宫颈口，以左手四指隔直肠壁把持子宫约8厘米，有软骨性感触，将输精管前端伸入至接近颈管内口处，此时插入深度大约6—7厘米即可，随着注入精液的同时后撤输精器。此法输精受胎率高，已被广泛采用。输精时应尽量做到一头牛一支输精器。如输精器不足，需连续使用时，被污染的输精器应先用蒸馏水棉球擦净其表面附着的污物、粘液后，用缓冲液棉球擦其尖部。用蒸馏水冲洗两次后方可抽精液进行第二次操作。
输精后，要用蒸馏水棉球擦输精器表面的污物，用蒸馏水反复冲洗，洗净后包好放入防尘罩内备用。
（四）细管精液输精方法
凯苏式输精器（或称凯苏枪，下同）是专门用于细管冷冻精液输精的。
1.解冻。
2.用剪子把细管精液的另一端封口部分剪掉。
3.将凯苏式输精器的刚探针往后拉10厘米左右，装入解冻后并经过镜检合格的细管精液，将棉塞端插入输精器套管内，并使钢探针伸入到细管的0.5厘米处。
4.输精
七、妊娠诊断
母牛输精30天后进行怀孕检查，如确定怀孕，就应以孕牛对待，注意保胎，防止流产；如未怀孕，要继续观察发情，适时输精，防止空怀。未怀孕，也不发情，应查找原因，及时采取措施，确保其发情、怀胎。
妊娠诊断的方法一般常用有两种：即外观检查和直肠检查。
1.外观检查：此方法需到5—6个月后方能进行，确定母牛是否妊娠。主要观察母牛配种后是否重复发情，在正常的情况下，母牛妊娠后不再有发情表现，膘情迅速上升，放牧、饮水及在圈内休息时溜边。母牛妊娠后期右侧腹部增大，饮水时还能望见胎动现象。
2.直肠检查：通过直肠检查卵巢和子宫角形状的变化判定是否妊娠。授精20—30天左右，排卵一侧卵巢有明显突出较大的妊娠黄体，方可判定妊娠。40天左右，两侧子宫角不对称，未妊娠角有明显的收缩感，可判定为妊娠。
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