關鍵詞﹕微生物﹔印染廢水﹔脫色﹔生物降解
印染廢水中的大部分有机物是可以生物降解的，即使是苯環結构的有机物也能被諾卡氏菌、環形小球菌分解﹒微生物對降解或轉化外來化合物具有巨大的潛力，几乎所有的有机物都能找到使之降解或轉化的微生物﹒生物化學處理廢水具有運轉費用低、處理效果好、操作簡單等优點，受到人們的重視﹒隨著生物工程技術的發展，微生物在印染廢水的生化處理中將會有更廣闊的應用前景﹒本試驗從活性污泥中篩選出高效的脫色菌种，并對其脫色和降解能力進行了表征﹒
1試驗
1﹒1材料及儀器
印染厂廢水池污泥﹔活性艷橙K-7R、酸性紅B、活性綠KE-4B、酸性藍BR﹔無水葡萄糖(天津市佳興化工儀器工貿有限公司)，NaH2PO4.2H2O(天津市化學試劑六厂)，(NH4)2SO4、MgSO4.7H2O(天津市化學試劑三厂)，K2HPO4(天津福辰化學試劑厂)，CaCl2(天津市天達淨化材料精細化工厂)，均為分析純﹔瓊脂(中國醫藥上海化學試劑公司)﹔蛋白 (天津市光复精細化工研究所)﹒
富集培養基﹕牛肉膏3g，葡萄糖20g，NaCl5g，水1000mL﹔平板培養基﹕牛肉膏3g，葡萄糖xg，NaCl5g，蛋白胨5g，瓊脂15g，水1000mL﹔液体無机培養基﹕NaH2PO4.2H2O0﹒5g，MgSO4.7H2O0﹒2g，K2HPO40﹒5g，硫酸銨2g，CaCl20﹒1g，水1000mL﹒
儀器﹕LRH-150型生化培養箱(上海益恒實驗儀器有限公司)﹔UV-401PC型紫外分光光度計(日本島津)﹔LG10-2﹒4A型高速台式离心机(北京醫用离心机厂)﹔LD型電子天平(沈陽龍騰電子有限公司)﹔HYG-A型全溫搖瓶柜(太倉市實驗設備厂)﹔XSP-16A型顯微鏡(南京精細儀器厂)﹔蒸汽滅菌器(上海三申醫療器械有限公司)﹔7221型分光光度計(上海第三分析儀器厂)﹒
1﹒2用液体無机培養基對菌株進行培養
用接种環以無菌操作從平板培養基中挑取少量菌体后送入裝有液体無机培養基的錐形瓶中，使菌体分散于液体中﹒把錐形瓶放入全溫搖瓶柜中培養，培養溫度37℃，轉速150r/min，制備菌懸液，并在不同時間觀測，記錄細菌的生長情況，然后再放入富集培養基對菌种進行培養﹒
1﹒3菌种的馴化与篩選
活性污泥的純种分离﹕首先用10倍稀釋法制備菌懸液，然后用平板划線分离，對分离出的單株菌落進行脫色試驗，篩選出對染料具有較好脫色作用的菌株﹒
菌种的馴化﹕液体無机培養基中加入質量濃度依次增加的系列染料對菌种進行馴化，先以低質量濃度的染料培養基對菌种進行培養，逐漸使微生物對染料有适應能力，增強其對染料的脫色能力﹒
脫色試驗﹕通過試驗對比不同菌株對酸性紅B和酸性藍BR的脫色能力﹒試驗條件﹕葡萄糖質量濃度為20g/L，分別裝入150mL錐形瓶中，高溫滅菌﹒接入菌懸液各1mL，培養溫度37℃，放入轉速150r/min的全溫搖瓶柜，48h后加入染料酸性紅B、酸性藍BR，染
料質量濃度20mg/L﹒在不同時間用紫外分光光度計在最大吸收波長處測其吸光度，計算脫色率﹒
1﹒4脫色檢驗
將一定量的菌种接种于染料液体無机培養基中，放入全溫搖瓶柜中振蕩培養一定時間進行脫色，溫度和轉速同1﹒2，在不同時間間隔取樣，用高速离心机分离，轉數為8000r/min，取上層清液，測出在最大吸收波長處的吸光度Abs值，以脫色率表示菌株對染料的脫色能力﹕
脫色率=(A-B)/A×100%
式中﹕A為脫色前染料在最大吸收波長處的Abs值﹔B為脫色后染料溶液在最大吸收波長處的Abs值﹒
2結果与討論
2﹒1菌种的分离与篩選
2﹒1﹒1菌种的馴化与篩選
在液体無机培養基中加入染料紅B，使其質量濃度分別為10、20、40、60、80、100mg/L，依次增加用量對菌种進行馴化，最終馴化出對染料具有脫色效果的3种菌，分別命名為B、F、W﹒
用不同菌株(B、F、W)對酸性紅B和酸性藍BR進行脫色試驗﹒結果表明﹕3种菌對染料化合物的脫色能力不同，W菌對2种染料的脫色能力低于B、F菌﹒因此，采用B、F菌作為試驗菌种﹒
2﹒1﹒2用富集培養基對菌株進行培養
試驗結果表明，接种少量的B、F、W菌体后，3种菌的生長曲線隨著時間的延長都呈上升趨勢，特別是B菌在24h左右達到一個峰值﹒實踐証明﹕菌株的OD值(培養液混濁度)過大反而不利于觀察染料脫色試驗現象，綜合考慮各項因素后選擇在菌株培養約24h后將其接出，用于對染料進行脫色﹒
2﹒2外加碳源(葡萄糖)及其質量濃度對染料脫色的影響
由圖1可知，添加葡萄糖的脫色效果优于不外加碳源的﹒雖然染料也是一种碳源，但只是一种不易被微生物利用的碳源.外加葡萄糖碳源可以加速微生物的生長，增加細菌對染料的吸附和脫色能力.此外，外加碳源可以促進細菌脫色能力的再生，增加菌体對染料廢水的處理次數，提高染料的脫色降解速率[1，2].
試驗結果表明﹕在微生物的生長過程中，代謝所需的碳源量是一定的，即當染料与葡萄糖同為外加碳源時，葡萄�潜热玖细妆晃⑸锢茅q葡萄糖質量濃度為10-20g/L時，B菌對酸性藍BR和酸性紅B的脫色率在較短的時間內可達到95%以上，染料与葡萄糖均能被微生物所利用，同時作為微生物生長的碳源﹔當葡萄糖質量濃度增大至30-40g/L時，微生物的生長主要依靠葡萄糖而對染料沒有產生代謝作用﹒此時，染料不能通過微生物的降解作用達到脫色效果，而僅是吸附在細菌表面，通過离心去除而達到脫色的效果﹒因此，葡萄糖質量濃度采用10-20g/L﹒
2﹒3溫度
在質量濃度為15g/L的葡萄糖液体無机培養基溶液中加入染料(質量濃度40mg/L，下同)，然后加入已純化的B菌和F菌，分別置于25、30、35、40℃，150r/min全溫搖瓶柜中脫色40h﹒
如圖2、圖3所示，B菌在30℃時對染料的脫色率約為95%，40℃時下降到79﹒59%﹒而F菌脫色的最佳溫度是35℃，超過該溫度脫色率也會下降﹒表明溫度的升高會使酶的活性降低、染料的脫色率下降，溫度
過高(超過細菌所能适應的溫度)，菌的酶系統被破坏，導致該菌活性下降甚至死亡，脫色能力下降﹒在25℃時，菌株的脫色率僅為6﹒36%，其原因是溫度過低，不利于菌的生長，酶的活性太低不利于染料脫色﹒B菌和F菌的适宜生長溫度分別是30℃和35℃﹒
2﹒4時間
時間對脫色率的影響如圖4、圖5所示﹒在35℃條件下，F菌在0-20h內對染料化合物的脫色率呈直線上升趨勢，脫色時間少于20h，微生物對染料的脫色速率較大，20h后脫色曲線趨于平緩，F菌脫色時間選擇23h﹔B菌對染料的脫色速率開始時很快，30h后增長變緩，B菌脫色時間選擇30h﹒其原因是微生物的生長分為4個生長階段，分別為适應階段、對數生長階段、平衡階段及內源代謝階段﹒适應階段即微生物對新環境的适應時期，期間微生物的個体逐漸增大而數目不變，待适應環境后，微生物迅速繁殖﹔對數階段即底物供應量超過微生物對底物的需要量，微生物的生長不受底物限制，只受自身生理机能的影響﹔平衡階段即底物量減少，微生物的有毒代謝物積累，生長率相對對數生長階段而言呈下降趨勢﹒此時，微生物生長速率主要不是受自身生理机能的限制，而是受有毒代謝物的增加与底物量不足的限制[3，4]﹒
B菌在脫色初期對酸性紅B的降解效果优于活性綠KE-4B和活性艷橙K-7R，在脫色時間內只有酸性紅B完全降解，其他2种染料均有少量吸附于微生物表面﹒因為染料化合物的結构影響降解效果，酸性紅B、活性艷橙K-7R為單偶氮類染料，但活性艷橙K-7R的結构比酸性紅B的結构复雜，活性綠KE-4B為雙偶氮染料，其分子結构比單偶氮染料更复雜，分子質量更大，所以更難降解[1，5]﹒
2﹒5pH值
一般微生物對pH值的變化十分敏感，即适應范圍很窄﹔但也有微生物對pH值的變化不靈敏，适應范圍較寬﹒pH值的變化能夠引起 构象的改變，影響微生物的生長与代謝等，最終影響其對染料的降解和脫色效果﹒環境pH值過高或過低都會對微生物的生長造成不利的影響﹒一般微生物要求環境的pH值為5-9，最寬的范圍為4-10，而最适宜的pH值較窄(6﹒5-7﹒5)﹒
采用1mol/L的HCl或者NaOH溶液調節培養基的pH值，高溫滅菌后接种菌B、F各1mL，分別放入恒溫水浴(30℃和35℃)搖床中(150r/min)培養，脫色，于不同時間下測量菌液的OD值﹒結果如圖6和圖7所示﹒
從圖6、圖7可以看出，pH在3-4時脫色菌的生長情況不是很好，其OD值很低﹒但大于4時OD值有所回升，pH在6-8時OD值到達了最大值，超過此范圍后OD值開始下降﹒另外，在生長前期，pH值對微生物的OD值影響不明顯，隨著培養時間的延長，pH值對微生物的影響越來越顯著，在不同pH值范圍內的OD值差异較大﹒
本試驗中脫色菌最佳脫色的pH約為7﹒微生物在基質中生長，代謝作用改變了基質中氫离子質量濃度﹒隨著環境pH值的變化，微生物生長受阻，當超出最低或最高pH值時，微生物死亡﹒為了維持微生物生長過程中pH值的穩定，配制培養基時要注意調節pH值，有時還要加入緩沖物以保証pH在微生物生長繁殖過程中的相對穩定﹒
2﹒6紫外-可見光譜
如圖8所示，降解前酸性紅B在515nm可見光區有一個強吸收峰，降解后，515nm處的吸收峰隨著降解時間的延長而逐漸減小，而在紫外波長范圍內的吸收峰卻逐漸增強﹒由此可以証明﹕酸性紅B被脫色菌降解，并且有新的降解物質(染料降解物)產生﹒
研究結果表明﹕利用微生物 可以破坏染料的不飽和鍵及發色基團﹒微生物對染料脫色具有專一性，其降解過程分2階段完成﹕
(1)染料分子的吸附和富集﹔
(2)染料分子被氧化、還原、水解、化合后，最終降解成簡單無机物或轉化為各种營養物及原生質﹒印染廢水的微生物脫色，關鍵在于微生物菌源的選擇，使之适應不同的印染廢水水質﹒
3結論
3﹒1菌种的篩選、馴化按照現行普遍的方法從活性污泥体系中分离、純化，得到B、F2株對染料有脫色作用的菌种﹒對酸性紅B、活性綠KE-4B、活性艷橙K-7R、酸性藍BR具有較好的脫色效果﹒
3﹒2培育菌株以染料為單一碳源時并不能表現出好的脫色效率，加入葡萄糖為輔助碳源，則表現出較強的去除染料的能力﹒
3﹒3脫色的最佳工藝條件﹕培育菌种溫度對B菌為30℃，F菌為35℃，pH值為7，葡萄糖的質量濃度為15g/L時微生物對染料的脫色效果較好﹒對酸性紅B的脫色時間﹕F菌選擇23h、B菌選擇30h﹒
3﹒4從酸性紅B染料降解過程的紫外-可見光譜圖可以看出，染料的特征吸收峰逐漸減小并伴有新的降解產物的吸收峰出現﹒
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