1 引言
为了有效地控制水体富营养化，强化生物除磷(Enhanced Biological Phosphorus Removal，简称EBPR)在废水生物处理磷过程中起到了关键性作用(Oehmen et al., 2007).EBPR即在厌氧-好氧交替运行条件下，活性污泥中的聚磷微生物选择性地富集成优势菌群，厌氧阶段，聚磷菌(PAOs)通过分解胞内聚磷产生的能量，吸收胞外的挥发性脂肪酸，同时降解糖原提供还原力以合成聚β羟基烷酸酯(PHA);好氧阶段，聚磷菌利用分解胞内的PHA产生的能量，用于细胞生长、聚磷合成和糖原恢复，通过好氧末端排泥实现生物除磷的目的.
糖原是强化生物除磷过程中产生的一种胞内聚合物.PAOs在厌氧条件下吸收基质不仅需要利用分解多聚磷酸盐产生的能量，还需要糖原为其提供部分能量和还原力.因此，提供一种快速的分析污泥胞内糖原含量变化的方法将有助于对强化生物除磷原理的进一步认识.目前，污泥胞内糖原的化学测定主要利用蒽酮比色法.测定原理主要是将冷冻干燥污泥进行不同方式的预处理，利用强酸可使糖类脱水生成糖醛，生成的糖醛或羟甲基糖醛与蒽酮脱水缩合，形成蓝绿色的糖醛衍生物，该物质在600～650 nm波长处有最大吸收，可以得到吸光度值与糖原含量的线性关系(Chen et al., 2005).
利用蒽酮法测定污泥胞内糖原含量比较繁琐，且容易造成污泥样品的不可逆性破坏.污泥的红外光谱分析亦是一种测定污泥胞内糖原含量的重要分析方法，近年来，伴随着科学技术的不断发展，傅里叶红外光谱技术在科研领域逐渐得到了广泛使用.红外光谱技术可以对微克级甚至是纳克级样品进行定性和定量分析，具有过程简便、噪声低、光通量高、分辨率高、波数准确度高、测定的光谱范围宽和扫描速度快等优点(翁诗甫，2005).
糖原是由葡萄糖通过化学键而聚合在一起的多聚物，具有特征的红外光谱吸收峰.Garip等(2009)通过研究Micrococcus 种属的细菌的红外光谱发现，糖原的红外吸收峰分别位于1074 cm-1和550 cm-1 处.Mehrotra等(2007)通过研究人体组织中正常细胞与癌症细胞的红外光谱，考察了蛋白、核酸和糖原的特征峰的峰位和峰强，比较了糖原与蛋白的峰强之比，定性和半定量地评价了从正常细胞向癌细胞转变的过程.因此，通过糖原特征峰强度的变化可以定性或者半定量表征糖原含量的变化.进一步而言，还可以采用偏最小二乘法(PLS)或者BP神经网络算法对各类样品的红外光谱进行定量分析.例如，李振庆等(2009)采用改进偏最小二乘回归法将选出的波长区与巴氏杀菌纯牛乳中脂肪、蛋白质及乳糖成分建立模型，结果表明，模型的拟合程度较高，得到了很好的预测效果.林萍等(2009)应用偏最小二乘法和人工神经网络相结合的方法对白砂糖、木糖醇、双歧糖和葡萄糖进行了定性分辨和定量分析.活性污泥样品是十分复杂的混合物，课题组以前的研究中也曾比较了污泥样品与标准样品的红外光谱峰，初步确定了糖原的特征吸收峰，并采用特征峰强度比值对活性污泥中的糖原含量进行了初步定量表征(李瑞，2012).然而，仅仅通过峰位比对来确定目标物质的特征吸收峰相对粗糙，若能采用标准加入法对污泥中的糖原峰进行定性表征，则可以得到糖原物质在污泥样品中的一系列特征吸收贡献区域.在此基础上，选定特征光谱区间并采用偏最小二乘法或人工神经网络法建立样品红外光谱与糖原含量的关系模型，则可以用于未知样品的快速表征和定量分析.基于此，本文采用傅里叶中红外光谱对强化生物除磷过程中污泥胞内糖原物质进行表征，并将污泥样品与糖原标样的红外光谱进行对比.同时，采用红外光谱945～1150 cm-1区域内的吸收光谱数据，结合测得胞内糖原的含量，应用偏最小二乘法和BP神经网络算法分别建立污泥红外光谱与糖原含量的定量分析模型.
2 材料与方法
2.1 反应器描述
采用序批式反应器(SBR)富集聚磷菌，以实现强化生物除磷的目的.反应器有效容积4 L，8 h一个循环，每个循环进水2 L，以乙酸钠为唯一碳源，COD为400 mg · L-1，NH4Cl作为微生物的唯一氮源，KH2PO4与K2HPO4作为微生物的磷源，进水中磷的浓度为20 mg · L-1，碳磷比为20 ∶ 1.单个循环时间设置见表 1.反应器的水力停留时间为16 h，每个周期好氧末端排泥150 mL，污泥停留时间为8.9 d.
表1 反应器各阶段运行时间
2.2 反应器进水组成
反应器合成废水由0.3 L溶液A和1.7 L溶液B组成，其中，溶液A和溶液B的组成成分见表 2.
表2 反应器进水组分一览表
2.3 样品采集与实验方法
待反应器进水完成后，分别在0、30、60、90、120(厌氧末端)、150、180、240、300 min(好氧末端)时进行取样，共进行了3次平行试验.对取得的所有样品进行泥水分离，得到上清液和湿污泥样品.对湿污泥进行抽滤，然后放入FD-1A-180冷冻干燥机进行冷冻干燥24 h，得到冷冻干燥污泥.取样品上清液，根据《水和废水监测分析方法》对COD和正磷酸盐进行检测分析(魏复盛，2002).
冷冻干燥污泥的蒽酮比色测定方法如下：取10 mg冷冻干燥污泥，加入10 mL 75%的硫酸溶液反复振荡，在100 ℃下消解10 min，取1 mL稀释至10 mL，再从10 mL中取1 mL在冰水浴中加入蒽酮试剂(取0.2 g蒽酮溶解到80%硫酸中，以80%硫酸定容到100 mL，现配现用)5 mL，转移至沸水浴中加热10 min，取出试管重新置于冰水浴冷却至室温，用分光光度计在620 nm处测定吸光度值.
采用中红外透射法测量样品时，基质溴化钾(KBr)与样品的合理压片过程能有效避免量测光谱时出现克里斯坦森效应(黄冬晨等，2013).因此，冷冻干燥污泥的傅里叶红外光谱检测方法如下：利用KBr作为背景，将KBr用研钵压制成薄片并放入傅里叶红外光谱中扫描，得出背景光谱;在KBr中加入1%的待测污泥样品，在研钵中进行混匀后压制成薄片再次放入傅里叶红外光谱中扫描，得到待测污泥样品的傅里叶红外光谱图.
3 结果与讨论
3.1 反应器的运行状态
图 1是第一次实验的化学分析结果.从测得的化学指标可以看出，反应器进水COD为166.5 mg · L-1，正磷酸盐浓度为22.5 mg · L-1，经过30 min的厌氧搅拌后，废水中的COD基本完全降解，这可能是活性污泥的初期吸附所造成的底物浓度迅速下降;2 h后的厌氧末端COD降解到81.0 mg · L-1，正磷酸盐浓度上升至160.5 mg · L-1，聚磷菌胞内的释磷量为进水的6倍，说明伴随着底物(乙酸钠)的不断降解，微生物胞内的聚磷被利用降解成正磷酸盐释放到细胞外的水体中，导致水体中的正磷酸盐含量增加，厌氧末端水体中的正磷酸盐浓度达到最大.经过后期3 h的曝气处理后，伴随着水体中COD的进一步降解利用，水体中的正磷酸盐被微生物过量吸收并以聚磷的形式储存于细胞内，好氧末端COD为48.0 mg · L-1，正磷酸盐浓度为15.44 mg · L-1.通过每周期排150 mL污泥的形式达到了生物除磷的目的.
图 1 SBR反应器运行过程中水质指标和胞内糖原物质含量的变化
在EBPR反应器处理废水过程中，糖原不仅可以为厌氧阶段提供一部分能量，还可以为PHA的合成提供还原力.在厌氧阶段所消耗的糖原伴随着好氧阶段PHA的分解利用和底物的进一步消耗而得到了补充.从图 1可以看出，在厌氧末端(120 min)，污泥胞内糖原含量达到最低，占污泥总质量的6.45%，经过曝气3 h后，污泥胞内糖原的含量上升至8.78%.说明在生物除磷过程中，污泥胞内的糖原物质参与了微生物的活动.
3.2 标准污泥胞内聚合物的红外光谱分析
由于多糖分子中的C—OH伸缩振动频率与醇分子中的C—OH伸缩振动频率基本相同，位于1200～1000 cm-1之间，但多糖分子中又存在多个C—OH基团.因此，从图 2a可以看出，在这个区域往往会出现几个峰位，图中1020、1082和1158 cm-1处的特征峰是来自糖原分子中C—OH的吸收(Taylor et al., 2011).从图 2b可以看出，聚磷(poly-P)的特征峰主要有两个，一个位于1167 cm-1处的主峰和一个位于900 cm-1的次峰，它们分别是由PO2对称伸缩振动和P—OH基团的伸缩振动引起的吸收峰.从图 2c和2d分别可以看出，PHB的红外特征峰主要位于1723 cm-1处，牛血清蛋白(BSA)在1657 cm-1和1541 cm-1处分别有较强的I吸收峰、II吸收峰，这与之前文献(Padermshoke et al., 2005; Adt et al., 2006)中报道的结果十分吻合.
图 2 标准糖原、聚磷(多聚磷酸盐)、PHB和牛血清蛋白(BSA)的红外光谱图
为了进一步说明污泥胞内糖原分子C—OH基团在1020、1082和1158 cm-1处有很强的吸收峰，本文在污泥样品中加入不同含量的标准糖原样品，得到的光谱图见图 3.从图 3可以看出，加入糖原后，红外光谱在1020、1082和1158 cm-1处有显著增加，并且随着糖原投加比例的增加，其吸收峰强度明显加强，其中，在1020 cm-1的吸光度分别从0.185增加为0.237和0.379.因此，应该优先选用该处的红外峰作为糖原的特征峰.
图 3 活性污泥中加入不同比例的标准糖原物质后的红外光谱图
3.3 污泥样品的红外光谱分析
图 4是第一次实验各取样时间节点的污泥样品红外光谱图，由于污泥样品在1158 cm-1处的吸收峰强度不是很明显，故采用1020 cm-1与1082 cm-1处糖原分子的吸收峰强度来反映污泥胞内糖原含量的变化.就1020 cm-1处的红外吸收而言，进水开始阶段污泥胞内的糖原分子的C—OH特征峰强度相对较高，吸收值为0.611.进入厌氧阶段后，强度逐渐减弱，厌氧1 h后，降至0.585，到厌氧末期达到最低，降至0.549.经过好氧阶段处理后，胞内糖原的特征峰强度明显升高，好氧1、2、3 h的1020 cm-1处红外峰吸光度分别为0.584、0.619和0.648，这显然与蒽酮比色法测得的糖原含量变化趋势是一致的.
图 4 反应器不同运行节点的污泥样品红外光谱图
3.4 污泥胞内糖原含量的偏最小二乘和BP神经网络算法分析定量模型
采用前两次实验获得的18个样品在945～1150 cm-1区域内的中红外光谱数据建立模型，并利用第3次实验获得的9个污泥样品数据验证模型的有效性.将光谱数据经过归一化处理后转化为吸光度数据，利用偏最小二乘法建立光谱数据与化学指标之间的定量分析模型，结果见图 5和图 6.
图 5 交叉验证预测残差平方和PRESS随主成分个数的变化趋势图 
以光谱数据为自变量，以糖原的化学分析结果为因变量，利用偏最小二乘法提取自变量的主成分个数.从图 5和图 6可以看出，随着主成分个数的增加，交叉验证预测残差平方和PRESS呈现出逐渐减小的变化趋势，而提取的自变量和因变量信息却一直呈现出增加的趋势.当自变量主成分个数为4时，PRESS基本已达到最低点，此时体现了99.52%的自变量信息和98.68%的因变量信息.随着主成分个数的继续增加，PRESS有所增加，而体现的信息量却变化很小，说明过拟合将噪声组分添加到模型中后，模型预测效果会变差(朱尔一，2005;吴桂芳等，2008).故选择该模型的最佳主成分个数为4，此时的测量值与预测值的相关性如图 7a示.
图 7 测量值与预测值之间的相关关系图(a.PLS法；b.BP神经网络法)
BP神经网络算法将选取的中红外光谱数据作为训练样本集，污泥胞内糖原的化学指标作为测试样本集.第一隐含层神经元个数为5个，采用的是双曲正切S型传递函数(tansig);第二层输出层神经元个数为1个，采用的是线性传递函数(purelin)，利用弹性梯度下降法的训练函数(trainrp).网络配置参数设置为训练显示间隔50次，最大迭代次数500次，学习步长0.05，期望目标误差最小值为10-4.对该网络进行训练10次，从10次训练结果中选择相关程度最高的作为污泥胞内糖原含量的预测模型.该预测模型的均方误差(Mean Squared Error，MSE)随循环次数的增加而减小，最终基本达到期望目标误差最小值，变化过程如图 8所示，其相关关系如图 7b所示.
图 8 均方误差(MSE)随循环次数的变化趋势图
应用偏最小二乘法和BP神经网络算法分别建立污泥样品的红外光谱与胞内糖原的化学指标之间的分析定量模型，这两种模型得出糖原的测量值与预测值之间的相关系数分别为0.921、0.893.并采用第3次实验的9个污泥样品验证上述模型的有效性，其误差分析比较见表 3.
表3 糖原百分含量的测量值与预测值的比较
偏最小二乘法模型的交叉验证均方根残差RMSEC=0.22%，预测值的平均绝对误差为0.19%，BP神经网络算法模型的预测值平均绝对误差为0.32%，表明采用偏最小二乘法比神经网络算法具有更小的平均绝对误差. 由于BP神经网络算法的预测性受隐含层神经元个数的影响，其中，隐含层神经元个数过少，网络中的权重不充分，此时的网络不能够较好地描述试样集的固有规律，即不能够得到很好的预测数学模型;隐含层神经元个数过多，会发生过拟合，使误差变大(焦淑菲等，2010).而偏最小二乘法则不受这些因素的影响，并且在线性相关程度上也明显优于BP神经网络算法.因此，偏最小二乘法是污泥胞内糖原物质定量分析的一种快速有效方法.
4 结论
1)在厌氧-好氧交替的强化生物除磷过程中，伴随着底物乙酸钠的降解，污泥胞内的糖原存在着厌氧分解和好氧合成的两个过程，其变化可以通过红外光谱来表征.
2)污泥样品的红外光谱图中位于1020 cm-1与1082 cm-1处的峰来自于糖原分子中C—OH的贡献，该特征峰的强弱可以直观地反映出在生物除磷过程中污泥胞内糖原的变化过程.
3)利用偏最小二乘法和BP神经网络算法分别建立污泥样品945～1150 cm-1区域的红外光谱数据与蒽酮比色法测得的化学指标之间的定量分析模型.结果显示，偏最小二乘法比BP神经网络算法预测污泥胞内糖原物质具有更好的预测精度和较小的平均绝对误差，其测量值与预测值的相关系数为0.921，平均绝对误差达到0.19%.
