1 引言
N2O致温效应为CO2的300多倍、CH4的4～21倍，估计地球上N2O排放对全球温室效应的贡献约占5%～6%(IPCC，1996).污水处理厂氮去除过程会产生大量N2O(Tallec et al., 2006; Kampschreur et al., 2008)，占水处理全过程释放的温室气体(包括CO2，CH4和N2O)总量的26%(Kampschreur et al., 2009).我国城镇污水处理厂2011年N2O释放总量估计约为1.26×109 g(以N计)(王亚宜等，2014).因此，污水生物脱氮过程中N2O产生及控制是目前研究的热点之一.
污水生物脱氮过程中硝化及反硝化过程均能产生N2O(Kampschreur et al., 2009;Wunderlin et al., 2011;刘秀红等，2006)，自养硝化过程N2O通过AOB硝化菌反硝化或羟胺氧化(化学和生物)产生，其N2O的产生涉及多种酶参与(见图 1)，羟氨氧化还原酶(Hydroxylamine oxidoreductase，HAO)是在硝化阶段将羟胺转化成亚硝酸盐的氧化还原酶，位于细胞膜外周质中.有研究表明，羟胺在好氧和厌氧条件下均能被HAO氧化(Yamanaka and Sakano et al.，1980)，而N2O是羟胺氧化的副产物(Otte et al., 1999).可见HAO对N2O产生起着关键调控作用.
图1 污水处理硝化过程N2O产生的可能途径及相关酶 (其中：AOB(氨氧化菌，Ammonia-oxidizing bacteria)； AMO(氨单加氧酶，Ammonia mono-oxygenase)：HAO(羟胺氧化还原酶，Hydroxylamine oxidoreductase)；NOR(亚硝酸氧化还原酶，Nitrite oxidoreductase))
污水生物处理过程中，酶是控制N2O释放的关键所在(Richardson et al., 2009).目前，一些纯种自养和异养硝化菌的HAO已经分离提纯(Wehrfritz et al., 1993，1996; Kurokawa et al., 1985;Hoppert et al., 1995; Zahn et al., 1994;Ono et al., 1996)，这些HAO分子量和结构有所不同(Arciero and Hooper， 1993;Moir et al., 1996;Jetten et al., 1997a;Shimamura et al., 2008).但目前尚无污水生物处理活性污泥HAO的研究报道，一个原因可能是脱氮污泥中硝化菌种类复杂多样，不利于分离提纯HAO而制约了这方面的研究.
不同研究报道的HAO提取和活性测定方法有所不同，破碎细菌细胞的方法有超声法(Jetten et al., 1997b)、压力破碎法(Otte et al., 1999)，有研究使用高渗裂解液(Zhang et al., 2014)辅助细胞破碎;酶活性测定时以铁氰化钾作为电子受体，但是所使用的电子受供比也有差异，Otte等(Otte et al., 1999)在测定发酵罐中粪产杆菌的HAO时选用电子受供配比1 : 2，而Tateo Yamanaka等(Yamanaka and Sakanoet al.，1980)从Nitrosomonas europaea菌提取纯化HAO时表明，电子受体超过4倍的供体羟胺后，羟胺能迅速被氧化成NO2-.Mike等(Jetten et al., 1997b)在研究羟胺代谢时采用电子受供配比为5 : 2的反应试液.由此可见，目前尚无确定可行的活性污泥HAO酶提取和活性测定方法.
基于此，本文在前期研究(南亚萍等，2012;刘婧晶等，2014)的基础上，从破碎方法、裂解液的使用、酶活测定液电子受供比、反应终止剂等方面对污水生物处理活性污泥中HAO酶的粗提取及酶活测定方法进行了探索研究，旨在为进一步探索污水生物处理中N2O产生和控制的酶水平研究奠定基础.
2 材料与方法
2.1 材料来源
活性污泥取自实验室处理模拟城市生活污水的SBR反应器.该反应器的有效容积为6 L，每天运行3个周期，每周期8 h，包括进水10 min(充水比为1/2)，厌氧搅拌120 min，好氧240 min，沉淀40 min，出水10 min，闲置60 min.人工废水由葡萄糖、乙酸钠、氯化铵、磷酸氢二钾、氯化钙、硫酸镁和氯化铁配制而成，加入碳酸氢钠调节pH值为6.8～7.8(FE-20型酸度计，梅特勒-托利多(上海)有限公司).COD约为400 mg · L-1，氨氮约为60 mg · L-1，总磷约为5 mg · L-1.
反应器温度维持在25 ℃;污泥浓度维持在MLSS 3255 mg · L-1(MLVSS/MLSS值在0.80左右).控制曝气强度在0.6 L · min-1，好氧段DO浓度维持在0.3～0.6 mg · L-1.
当氨氮去除率达到90%以上并稳定运行时取样.取样时间点选择在每周期曝气开始后0.5 h.
2.2 HAO粗酶的提取
取25 mL泥水混合液，在4000 r · min-1离心3 min(J-26XP贝克曼高速冷冻离心机，美国贝克曼库尔特有限公司生产)，倾去上清液，沉淀用缓冲液(50 mmol · L-1 Tris-HCl，pH 7.8，5 mmol · L-1 MgCl2)定容到25 mL，再次离心3 min，倾去上清液，此步骤重复一次.沉淀备用定容至25 mL后，破碎细胞.4 ℃条件下，40000×g 冷冻离心30 min，上清液于4 ℃条件下贮存备用.
2.3 细胞破碎方法
超声法：用BILON92-II超声波细胞粉碎机(上海比朗仪器有限公司)于0 ℃的冰-水混合水浴中破碎细胞，调节输出功率200 W，工作3 s，间歇3 s，破碎次数分别设定为30次、60次、99次.
压力细胞破碎法：在4 ℃条件下用JN-02低温超高压连续细胞破碎仪(广州聚能生物科技有限公司)破碎，设定压力50、110、160 MPa，分别破碎1、2、3次.
超声与裂解液结合法：洗涤后的沉淀加细胞裂解液(50 mmol · L-1Tris-HCl(pH 7.5)，10%蔗糖，300 mmol · L-1 NaCl，90 mmol · L-1 EDTA)2 mL、5 mL、10 mL，10 min后，缓冲液定容至25 mL后进行破碎，方法同超声法.
压力与裂解液结合法：洗涤后的沉淀加细胞裂解液2 mL、5 mL、10 mL，10 min后，缓冲液定容至25 mL后进行破碎，方法同压力细胞破碎法.
2.4 破碎效果评价
用ND-2000微量分光光度计(美国Nanodrop科技有限责任公司)测定破碎后混合液中的DNA含量，将DNA含量高低作为衡量细胞破碎的程度的指标.
2.5 HAO酶活性测定
(1)酶活力测定原理：根据HAO酶的氧化还原特性，本实验以铁氰化钾为电子受体，以羟胺为电子供体.羟氨氧化还原酶的活性在400 nm处以铁氰化钾的还原量来计算酶活性.
(2)酶活性单位定义：25 ℃，pH 8.0条件下每分钟还原1 μmol K3Fe(CN)6的酶量为一个酶单位.按下式计算HAO酶的活性(U · mL-1)，摩尔吸光系数ε为1 L · mol-1 · cm-1.
酶活性:A =400/[ε·b×t]×VL/V×B 式中，t为时间(min)，VL为测定液体积(mL)，V为酶液体积(mL)，B为稀释倍数，b为比色血宽度(1 cm).
(3)酶活力测定步骤：取4 mL反应混合液放入试管中，加入适量酶提取液，立即混匀并计时，25 ℃恒温水浴仪(北京市永光明医疗仪器有限公司)中准确保温一定时间;反应完成后立即加入2 mL终止剂终止酶反应.室温放置5 min后，UV-2600A分光光度计(龙尼柯(上海)仪器有限公司)于400 nm处测定吸光度;空白对照管先加入2 mL反应终止剂，再加酶液.
2.6 测定方法
粗酶液中总蛋白质含量测定：Bradford法(Bradford，1976); DNA含量：微量分光光度法;酶活性测定：分光光度法.
2.7 酶活力测定方法的优化
(1)酶反应液电子受体与供体比的选定：选择电子受供比1 : 4、1 : 2、1 : 1、2 : 1、4 : 1，分别取5组平行样.
(2)反应终止剂的选择：选用20%三氯乙酸及2 mol · L-1 HCl，分别取5组平行样.
2.8 实验数据处理
多组平行试验结果均以平均值±标准差(±SD)来表示，组间比较采用SPSS13.0 软件进行单因素或多因素方差分析.
3 结果与分析
3.1 不同方法的破壁效果
HAO为细胞膜外周质酶，能否完全将菌体细胞壁破碎是该酶提取的首要因素.本研究探讨了五种不同的破壁方法，用微量分光光度计测定DNA含量确定破壁效果，同时测定酶活力.
首先对超声法同一功率下超声破碎次数对破碎效果影响进行实验，结果见表 1所示.
表1 超声处理次数对污泥破壁的效果
从表 1可知，超声破碎次数增加，DNA含量增加，提取的粗蛋白含量增加，HAO酶活增大，说明细胞破碎程度提高.单因素方差分析表明，破碎30次DNA及蛋白质量均明显小于60次和99次(p<0.05)，但是酶活与60次无明显差异，与99次相比明显偏小(p<0.05)，为了缩短实验时间及更好的保存酶活性，选择破碎30次进行后续实验.
表 2 是化学渗透对细菌细胞破碎效果的影响.从表 2可知，添加细胞裂解液后，酶活性及DNA比未加的条件下(表 1所示)增加近5倍及多至十几倍.从DNA结果来看，加5 mL和10 mL裂解液没有差异(p>0.05);酶活和蛋白质5 mL条件均显著小于10 mL及25 mL条件(p<0.05).但研究过程发现添加10 mL及更多裂解液时，用Br and ford法测定蛋白质容易产生沉淀，在此种情况下，用分光光度计测定蛋白质比较耗时，读数不稳定.
表2 化学渗透处理对污泥破壁的效果
基于上述超声次数和裂解液用量对细胞破碎效果的影响，研究进一步探讨超声、压力及裂解液相互结合对破碎效果的影响，以便找出耗时短、破碎效果好的破碎方法.图 2是不同破碎条件下，破碎次数和裂解液对细胞破碎效果的影响.
图2 不同破壁条件下，处理次数和裂解液对污泥破碎效果的影响(污泥以mL计)
从图 2可以看出，用细胞破碎仪破碎细胞效果明显比超声破碎细胞效果要好;无论是超声还是细胞破碎仪，加裂解液细胞破碎效果较不加的要好.
对3种压力下的DNA结果经多因素方差分析(0 mL未参与分析)，F(8，26)=7.281(p<0.01)，说明压力、破碎次数及裂解液用量均对破碎效果有极其显著的影响.随着细胞破碎仪破碎压力、次数增大，破碎效果增强;2 mL与5 mL裂解液之间破碎效果有显著差异(p<0.05)，而2 mL与10 mL、5 mL与10 mL裂解液之间之间破碎效果没有显著差异(p>0.05).从图中能看出，160 MPa条件下，加5 mL裂解液破碎3次效果是最好的.
3.2 酶活测定方法优化结果
在HAO酶活测定过程中，电子受供比和终止剂的选择对酶活力测定影响较大，因此，本研究进行了电子受供比和终止剂对酶活测定影响的研究.结果如下.
3.2.1 酶反应液电子受体与供体比的选定
不同微生物菌种、不同的生长环境，HAO的活性高低不尽相同，在以往HAO研究电子受供比1 : 2、≥4、5 : 2等的基础上，做了表 3所示的电子受供比实验.以确定适合污水脱氮处理工艺HAO酶活研究的配比.取5组试样进行测定.结果见表 3.
表3 不同电子受体与供体比下测定的HAO酶活性
在一定条件下，底物浓度饱和时，酶反应速度与酶浓度呈正比，当底物(不论K3[Fe(CN)6]还是NH2OH)浓度受限时，均会影响酶活性的测定结果.
表 3的结果表明，受供比1 : 4、1 : 2的酶反应液中由于受体K3[Fe(CN)6]不足，在短时间内吸光值减小的幅度很大.对测试样品数目较多的过程不适用.而受供比2 : 1、4 : 1条件下，同样反应时间内，受体K3[Fe(CN)6]剩余量较多.这4种受供比反应后不太适宜用分光光度计测定，因此宜选用电子受供比1 : 1的酶反应液做酶活性测试，本研究用这一受供比也获得了较其他条件下的最大酶活性(0.368±0.012 U · mL-1).
当然，这一配比适用于HAO粗酶测定，若是经过纯化后的HAO，适合的受供比需要进行实验来进一步确定.
3.2.2 反应终止剂
与加热酶失活方法相比，用酸碱让酶失活更易操作和节省时间，本研究中受体K3Fe(CN)6在碱性条件下不稳定，因此实验选取20%三氯乙酸和2 mol · L-1 HCl作为HAO酶活性反应的终止剂，选用电子受供比1 : 1的酶反应液.取5组试样进行测定.结果见表 4.
表4 反应终止剂对HAO活性测定的影响
从表 4数据可知，20%三氯乙酸与2 mol · L-1 HCl作为HAO酶反应终止的试剂，酶活测定值经单因素方差分析，无显著性差异(p>0.05).通过测试两者的pH，20%三氯乙酸(pH 1.8)溶液酸性极强，文献(Yamanaka and Sakano et al.，1980; Jetten et al., 1997b; Otte et al., 1999)中采用它作为HAO酶反应终止剂.铁氰化钾遇强酸时产生剧毒的氰化物，从减少环境污染和操作安全的角度，宜选用酸性较弱的2 mol · L-1 HCl溶液作为反应终止剂.
3.3 不同破碎条件下，裂解液和破碎次数对测定HAO酶活性的影响
从图 3可以看出，在不同压力条件下，用细胞破碎仪破碎细胞2次、3次的HAO酶活明显比超声条件下酶活要高;加裂解液破碎后HAO酶活要比不加裂解液的HAO酶活高.
图3 不同破碎条件下，破碎次数和裂解液对获得的HAO酶测定活性的影响
对3种压力下的酶活结果经多因素方差分析(0 mL未参与分析)，F(8，26)=2.718(p<0.01)，说明压力、破碎次数及裂解液用量均对酶活有极其显著的影响.只看压力变化时，两两压力之间酶活无差异(p>0.05);破碎2次与1次之间酶活有极其显著差异(p<0.01)，而破碎2次与3次之间酶活无差异(p>0.05).
在不同的压力条件下，均是加5 mL裂解液的HAO酶活性要高(与10 mL比无差异(p>0.05))，加10 mL裂解液后酶活反而降低，原因可能是细胞裂解液中含有EDTA，而HAO的活性位点由c型亚铁血红素和血红素P460构成(Hooper et al., 1997)，较多的裂解液加入影响了HAO的活性.
从图中看出，160 MPa条件下，加5 mL裂解液破碎细胞2次有最高的HAO酶活力.
3.4 破碎方法、裂解液和破碎次数对HAO酶比活力的影响
酶的比活力(specific activity)也就是酶含量的大小，即每毫克蛋白所具有的酶活力.酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高
从图 4可以看出，超声条件下，酶的比活力比细胞破碎仪破碎细胞酶比活要高;超声条件下，随着裂解液增多，酶比活力有所增大，但是增加幅度很小.
图4 不同破碎条件下，破碎次数和裂解液对获得的HAO酶的比活力的影响
对3种压力下破碎2次、3次的酶比活力结果经多因素方差分析(0 mL未参与分析)，F(4，17)=16.262(p<0.01)，说明压力、破碎次数及裂解液用量均对酶比活力有极其显著的影响.不同压力下酶比活力有极其显著差异(p<0.01);破碎2次与3次之间酶比活力有极其显著差异(p<0.01)，压力与次数相同的条件下，不同裂解液用量组间酶比活力无差异(p>0.05).
随着细胞破碎仪破碎压力增大，HAO酶比活力减小，说明压力增大后，细胞破碎效果增强，有更多的蛋白从细胞中溶出，而HAO酶的量则没有随之增加，分析原因可能是瞬间高压产生热量破坏了HAO及其活性.
综上所述，160 MPa条件下，加5 mL裂解液破碎3次效果是最好的，该条件下破碎细胞2次有最高的HAO酶活力，但是从酶比活力看，该条件下破碎2次和3次的酶比活力均比110 MPa加裂解液5 mL破碎2次要低(p<0.01)，因此综合DNA、酶活力和酶比活力考虑，110 MPa加裂解液5 mL破碎2次更适合污水生物处理中HAO的研究，既节省时间，又能较好的保持酶活性.
4 结论
1)压力、破碎次数及裂解液用量对脱氮活性污泥粗提液中DNA、HAO酶活力及酶比活力均有极其显著的影响(p<0.01).
2)无论是超声还是细胞破碎仪破碎细胞，加裂解液破碎效果比不加要好(DNA含量高)，有较高的酶活力(超3～7倍).随着细胞破碎仪破碎压力增大，破碎效果增强，160 MPa条件下，加5 mL裂解液破碎3次效果是最好的.
3)对相同提取条件下提取的粗酶液，酶活反应液电子受体供体之比为1 : 1时，分光光度法可获得较高的酶活力.
4)酶反应终止剂宜选用2 mol · L-1 HCl溶液.
5)综合DNA含量、酶活力及酶比活力考虑，110 MPa加裂解液5 mL破碎2次更适合污水生物处理中HAO的研究，既节省时间，又能较好的保持酶活性.
