四株微生物絮凝剂产生菌生长条件的研究

微生物絮凝剂是由某些微生物产生的生物大分子物质，它克服了常规的无机絮凝剂和有机絮凝剂对人体有害和易产生二次污染的缺点.产絮凝剂微生物生长所需要的营养物有6大要素，它们是碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水，各种微生物生长代谢过程中对6大要素的要求及各成分的含量是不一致的，因而每种菌在不同的培养基条件下产生的絮凝剂是不一样的[2～7].微生物的生命活动要求一定的外界条件，外界环境条件适宜时，微生物进行正常的生长繁殖，不适宜时，会使生长受到抑制或发生变异，甚至死亡.不同的环境因素对微生物的影响不同，同一因素的浓度或作用时间不同，对微生物的影响也不一样[8～9].本实验室通过筛选和诱变获得了HHE-P7、HHE-A8、HHE-P21、HHE-A264株高效絮凝剂产生菌，经鉴定菌株HHE-A26为半知菌类从梗孢科曲霉属杂色曲霉(Aspergillusversicol or)，HHE-A8为半知菌类从梗孢科曲霉属烟曲霉(Aspergillusfumigatus)；HHE-P7为半知菌类从梗孢科青霉属产紫青霉系(Penicilliumpurpurogenum)；HHE-P21为半知菌类从梗孢科青霉属圆弧青霉系(Penicilliumcyclopium).通过研究各种单一生长因素对这4株微生物絮凝剂产生菌生长及产絮凝剂的影响发现，淀粉、酵母膏分别是4株微生物絮凝剂产生菌生长的最适碳源和氮源；在中性或偏酸的培养基中菌种生长以及产絮凝剂都较好；温度在25～35℃范围内，各菌均有良好的絮凝效果，显著性差别不大(研究结果另文发表).在此基础上，为了进一步研究培养基组成对絮凝活性的影响，在众多影响因素中选出3个相对重要的影响因素，即淀粉、酵母膏、培养基的初始pH值，采用正交实验方法确定了絮凝剂产生的最适条件.
1 材料与方法
1.1 实验菌种由作者所在课题组选育得到絮凝剂产生菌HHE-P7、HHE-A8、HHE-P21、HHE-A26.
1.2 基础培养基可溶性淀粉、KH2PO42g、K2HPO45g、(NH4)2SO40 2g、NaCl0.1g、酵母膏、H2O1000mL，pH7.0～7.5，121 3℃灭菌20min.
1.3 高岭土悬浊液 在1000mL烧杯中加入1000mL自来水，加入4g过200目筛的高岭土(化学纯)，搅匀静置5min后，烧杯500mL处的悬浊液在550nm的波长下的吸光度为0 410.

1.4 正交实验的因素和水平的设计相对应的3个因素选取为淀粉，酵母膏，初始pH，每个因素考察3个水平，采用L9(34)正交表对培养基组成进行正交设计.实验的因素水平见表1，其余的各培养基成分的构成与基础发酵培养基相同.
1.5 产微生物絮凝剂的菌种培养将絮凝剂产生菌HHE-P7、HHE-A8、HHE-P21、HHE-A26分别接入装有50mL培养基的250mL的三角瓶中.各菌在30℃、150r/min恒温摇床振荡培养5d后，测定培养液的絮凝效果.
1.6 絮凝活性的测定采用目前常用的评价方法[12，13]：在150mL烧杯中加入100mL高岭土悬浊液，5mL1%(w)CaCl2溶液，2mL培养液，调节pH至7.5～8.5，快速(200r/min)搅拌2min，静置5min，吸取中部上清液于722型分光光度计550nm处测定吸光度(A)，以不加培养液的吸光度(B)为对照来确定发酵液的絮凝效果，以絮凝率表示，絮凝率(%)=(B-A)/B×100.
1.7 优化条件下各菌株产絮凝剂的试验在正交试验的基础上，得到各菌株的最佳配比的淀粉、酵母膏以及pH，培养基的其它成分与基础培养基相同.在此条件下，各菌在30℃、150r/min恒温摇床振荡培养5d后，测定培养液对高岭土悬浊液的絮凝率.
2 结果与讨论
2.1 正交试验结果正交实验结果见表2～表3，Pr>F表示因素影响的显著水平，该值小于0.05则影响显著，大于0.05则影响不显著.
3个因素对菌株HHE-P7产絮凝剂的影响都没有达到显著水平，Pr>F的值都大于0.05，其中淀粉、酵母膏的影响相对较大，相应的极差为2.37和2.28，初始pH值在试验范围内对菌株产絮凝剂的影响非常小，Pr>F的值接近1.淀粉中水平1的絮凝效果最好；酵母膏中水平3的絮凝效果最高；pH在4～6，其絮凝效果差异不大.由于基础培养基最初的pH值是6左右，因此pH值选6.实验号3的实验结果表明，该配比下HHE7产絮凝剂的效果最好.对菌株HHE-A8而言，酵母膏的影响达到显着水平，Pr>F的值为0.0217，极差高达6.5，培养基中酵母膏水平为1时，培养液的絮凝活性最高，淀粉和初始pH值对菌株产絮凝剂的影响不显著，其中淀粉的影响大于pH.淀粉中水平1和酵母膏中水平1的絮凝效果都最高，因此，优化配比为淀粉1和酵母膏1，pH值6.菌株HHE-P21的试验结果中，3因素对菌株产絮凝剂的影响都没有达到显著水平，相比较而言，酵母膏影响相对较大，极差为2.34，其次为淀粉，表明最主要的影响因素是酵母膏，淀粉次之，初始pH值对菌株产絮凝剂的影响程度相对最小.淀粉中水平2和酵母膏中水平1的菌产絮凝剂活性最高，因此，最适配比为淀粉2和酵母膏1，pH6.
对菌株HHE-A26，淀粉和酵母膏的Pr>F的值都小于0.05，表明不同的淀粉水平以及酵母膏水平都能显著影响菌株HHE-A26产絮凝剂.淀粉的影响最大，极差为2.86，酵母膏影响的极差为2.07，对菌株产絮凝剂的影响相对较小，初试pH值的影响很小.最适配比为淀粉1和酵母膏1，pH4，实验号1的实验结果表明，该配比下HHE-A26产絮凝剂的效果最好.通过正交实验考察及权衡经济因素，得出各菌株的优化配比条件见表4.
2.2 优化条件下各菌株产絮凝剂的絮凝效果以最优配比的培养条件进行实验，结果见表4.由此可见，在最优配比的条件下，各菌产絮凝剂对高岭土悬浊液的絮凝率都达95 86%以上，这进一步验证了正交实验所筛选得到优化配比结果的可靠性.

3 小结　通过正交实验初步确定了絮凝剂产生菌HHE-P7、HHE-A8、HHE-P21、HHE-A26产絮凝剂培养条件的最优配比.在其它培养基成分、用量与基础培养基相同的情况下，菌种最适的淀粉、酵母膏以及pH值的配比为：
(1)HHE-P7：淀粉10g/L，酵母膏5g/L，pH值6；
(2)HHE-A8：淀粉10g/L，酵母膏0.5g/L，pH值6；
(3)HHE-P21：淀粉20g/L，酵母膏0.5g/L，pH值6；
(4)HHE-A26：淀粉10g/L，酵母膏0 5g/L，pH值4.在适宜的培养条件下，絮凝剂产生菌HHE-P7、HHE-A8、HHE-P21、HHE-A26产絮凝剂对高岭土悬浊液的絮凝效果均在95%以上.