文章编号：2095-1922(2011)06-1168-05
微生物絮凝剂是一类由微生物产生的具有絮凝活性的代谢产物[1-2].到目前已报道的生物产生的絮凝物质为糖蛋白、黏多糖、蛋白质、纤维素、DNA等高分子物质[3-10].其高效无毒的特点受到越来越多的人的关注，但微生物絮凝剂对絮凝体系的条件有一定的要求，在限制性的条件下微生物絮凝剂的絮凝活性会受到影响，从而会影响絮凝效果.基于此，笔者对微生物絮凝剂的特性进行研究，采用测定高岭土悬浊液吸光度值的方法，由实验室制得的微生物絮凝剂的活性物质主要存在于离心上清液中，高岭土悬浊液絮凝体系的环境对微生物絮凝剂的絮凝效果有影响作用，微生物絮凝剂的主要成分是蛋白质.
1.材料与方法
1.1实验器材
高压灭菌锅、摇床振荡培养箱、恒温培养箱、电炉、培养皿(9cm×9cm)、试管、三角瓶(规格：250mL)、烧杯(规格：500mL)、量筒(规格：250mL)、紫外清洁台、分光光度计、离心机.
1.2菌株的筛选与纯化
将取自污水处理厂的活性污泥与无菌水中，搅拌均匀后静止20～30min，取5mL上清液于100mL培养基中富集培养2～3d，培养液适当稀释涂布于固体平板培养基上，于30℃恒温培养箱中，培养2～3d，选择不同的菌落接种于斜面培养基中，30℃恒温培养2～3d.重复上述操作至单一菌落.经高岭土悬浊液的絮凝率测定，筛选得到产絮凝剂微生物菌株S-3.
1.3微生物絮凝剂的制备
将培养48h的发酵液于4℃下，15000r/min离心30min，去菌体，上清液用蒸馏水洗涤，然后加入2倍体积的无水乙醇，混合均匀，得到白色絮状物，4℃下静置过夜，离心(15000r/min，5min)，将沉淀物用蒸馏水清洗，得到絮凝剂粗品.
1.4微生物絮凝剂絮凝率的测定
将高岭土在烧杯中配置成4g/L的悬浊液，用玻璃棒搅拌均匀后，取10mL高岭土悬浊液放入50mL比色管中，加入1%CaCl20.5mL溶液，再加入少量的絮凝剂溶液，将比色管上下颠倒数次，待高岭土混合液混合均匀后，静止10～15min后.小心移取上清液测其吸光光度值OD550，其值记为B，再测空白样的OD550值记为A，计算絮凝率为
絮凝率=(A-B)/A×100%.
(1)
2.结果与分析
2.1絮凝活性的分布情况
不同的微生物产生絮凝剂在发酵液中的分布是不同的，有的附着细胞表面，有的游离于发酵液中.将发酵液稀释后于4000r/min离心20min，得到菌体沉淀物和上清液，取上清液，再将菌体用蒸馏水制成菌悬液.分别测试发酵液、离心上清液和菌悬液的絮凝率，得到结果如图1所示.
从图1可看出发酵原液和离心上清液的絮凝效果好，絮凝率分别为86.7%和90.1%，而菌悬液的絮凝率仅为34.5%.这说明起絮凝作用的主要物质存在于发酵原液中，是由微生物产生并分泌到细胞外的.离心上清液的絮凝率比发酵原液的絮凝率略高，因为发酵液中含有无机盐硫酸铵，对絮凝效果有抑制的作用，所以用絮凝菌产生的絮凝剂最好用处理过的絮凝剂粗品，在实际应用中会取得较好的效果.
2.2pH对絮凝活性的影响
絮凝剂对与被絮凝的物质体系是有一定的pH值要求的，在最合适pH值条件下絮凝效果良好.因为胶体颗粒表面带有负电荷，在一定的pH值范围内，会减少胶体表面的电荷，颗粒之间的分子引力减小，颗粒与颗粒之间容易结合形成大的结构物质从而沉淀下来，达到絮凝的效果.取4g/L的高岭土悬浊液10mL，加入1%CaCl20.5mL溶液，再加入1mL的絮凝剂溶液，调解pH值分别为4、5、6、7、8、9作为测试值，测试对高岭土悬浊液的絮凝活性(见图2).
如图2所示，絮凝剂pH值适应范围较广，但当高岭土悬浊液pH值为8时絮凝率最高为88.5%，絮凝过程中可看到大片的絮花产生，高龄土悬浊液很快变得澄清.高龄土颗粒之间的结合力是很薄弱的，当OH-质量浓度的增加破坏了高岭土粒子之间的结合力，所以产生大量的絮花沉降下来.继续升高pH值，OH-会和Ca2+结合生成沉淀使絮凝率都有所降低，pH值在酸性条件下絮凝率不高，pH值为4时絮凝率仅为40.6%.实验得pH值为8时最为合适.
2.3温度对絮凝率的影响
生物絮凝剂的组成成分不同，所以对于温度的要求也是不同的，若絮凝剂的主要成分是蛋白质类，对温度的反应会很敏感，高温会使蛋白质变性失去活性也就会影响絮凝效果.若絮凝剂的主要成分是多糖类对于温度的变化就会在一定范围内表现得比较平稳，絮凝效果不会受到太大的影响.将发酵液经离心得到的上清液放入比色管中，然后在100℃的水浴锅中加热，测加热不同时间时，离心上清液对高岭土悬浊液温度对絮凝率的影响见图3.
从图3中可以看出随着水浴时间的增加，絮凝率逐渐的在降低.主要是由于温度不断地升高，生物絮凝剂中的蛋白质成分被不断的破坏，絮凝物质不断地失去絮凝活性，当加热到30min时，絮凝率几乎降为0.
2.4金属离子对絮凝率的影响
文献[15-16]报道添加Al3+和Ca2+能提高絮凝剂的絮凝活性，一些带电的金属阳离子加入絮凝体系中会与带负电的胶体离子反应，中和掉一部分电荷，减少胶体粒子之间的分子引力，易于发生桥联作用，产生大颗粒物质而沉淀.所以某些金属离子对于生物絮凝剂的絮凝作用有一定的辅助作用，但不同的微生物絮凝剂对不同的金属离子的要求也是不同的，实验选用Al3+、Ca2+、Mg2+、Na+作用金属离子加入到絮凝体系中，金属离子对絮凝率的影响见图4.
从图4中可以看出Al3+和Ca2+可以提高絮凝剂的絮凝作用，Mg2+和Na+的加入对于絮凝体系没有多大的影响.Al3+和Ca2+可以对絮凝作用大大超过其他阳离子，是由于一方面其本身就具有絮凝或助凝的作用；另一方面可能因为Al3+和Ca2+的大小刚好可以填充如蛋白絮凝剂某些表面点，增加了相互间的吸附和架桥作用.实验中加入少量的Al3+和Ca2+对与絮凝活性是有帮助的.
2.5Ca2+的加入量对絮凝率的影响
CaCl2是影响絮凝活性的重要因素[18-19].CaCl2对与高岭土悬浊液的絮凝活性有一定的促进作用，可能是因为Ca2+与加入的絮凝剂的表面点的大小相符合，并且中和部分胶体表面所带的负电荷，颗粒之间相互吸附产生大的颗粒物质沉淀下来，也就促进了絮凝剂的絮凝作用.配置50mL高岭土的悬浊液，质量浓度为4g/L，然后加入相同量的絮凝剂，加入1%CaCl2为2、4、6、8、10mL，测定高岭土悬浊液的絮凝率，不同量的Ca2+对絮凝活性的影响见图5.
从图5中看出Ca2+的量由0mL增加到6mL时絮凝率不断升高，6mL时达到最高92.4%，再增加量时絮凝率反而降低.可能是因为继续增加Ca2+的量在高岭土体系中达到过饱和状态，使悬浮颗粒同时带上正电荷，对絮凝产生了抑制作用.
2.6絮凝剂添加量对絮凝率的影响
向高岭土悬浊液中分别加1、2、3、4、5、6、7mL的絮凝剂及1%CaCl2溶液，测试絮凝率，絮凝剂添加量对絮凝活性的影响见图6.
从图6中看出当絮凝剂为1～2mL时，絮凝率最高.继续增加絮凝剂的量絮凝率开始下降.主要是因为过多的絮凝剂使溶液变得浑浊，絮凝剂表面沾有生物体影响了吸光光度值，所以絮凝率下降.
3.结论
(1)絮凝菌产生的絮凝物质主要存在发酵液中，离心上清液的絮凝活性最好.
(2)微生物絮凝剂在pH值为8时，絮凝效果最佳.
(3)絮凝剂对于温度比较敏感，高温会使絮凝剂失去活性.
(4)Al3+和Ca2+加入可以提高絮凝剂的絮凝活性，Ca2+的影响最大，在50mL高岭土悬浊液中加入6mL的氯化钙的絮凝效果最好为92.4%.
(5)50mL高岭土悬浊液中加入2mL絮凝剂时絮凝活性最高为93.1%，继续增加絮凝剂的量絮凝率会降低.
