微生物絮凝剂是一类由微生物分泌的，主要成分是糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素、DNA等高分子物质[1-2]，微生物絮凝剂本身具有生物可降解性，是一种高效、安全、无二次污染的新型絮凝剂[3-4]。
我国从20世纪80年代以来开始对生物絮凝剂的研究，并取得了相当的成就，赵继红等从活性污泥中筛选出一株活性高的微生物絮凝剂产生菌。我国生物絮凝剂的研制和应用大部分还处于实验室研究阶段，真正应用于工程实际的较少。在本研究中，拟从环境中筛选出絮凝活性高、用量少的微生物絮凝剂产生菌，并对其絮凝性能进行研究，旨在为生物絮凝剂的实际应用提供科学依据。
1.材料与方法
1.1试验材料
菌种来源：取自郑州五龙口污水处理厂曝气池的活性污泥。
分离培养基：牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌用)、高氏一号培养基(培养放线菌用)、查氏培养基(培养霉菌用)。
筛选培养基：葡萄糖20g，酵母浸膏0.5g，脲0.5g，K2HPO45g，KH2PO42g，NaCl0.1g，(NH4)2SO40.2g，水1000mL，pH值为7.0，115℃灭菌30min。
1.2试验方法
(1)菌种的分离与纯化。采用常规的稀释涂布法，经多次划线分离直至获得纯菌株。
(2)初筛。用250mL三角瓶装50mL培养液，灭菌后将菌株接入其中，30℃振荡培养4d，对所得培养液絮凝活性进行检测。在50mL比色试管中加入0.1g高岭土，定容至50mL，调节pH值为7.0，加少量培养液，加塞，摇匀，能使高岭土悬浊液絮凝成大颗粒即为有絮凝活性的菌株。
(3)复筛。将初筛获得的具有絮凝活性的菌株接种到装有50mL筛选培养基的灭菌后的250mL三角瓶中，30℃振荡培养72h，对所得培养液进行絮凝活性的检测，絮凝活性用絮凝率来表示。在50mL具塞比色试管中加入0.1g高岭土，定容至50mL，调节pH值为7.0，再加入2mL培养液，加塞，摇匀，静置5min，用移液管吸取上清液于比色皿中，于分光光度计在550nm处测定上清液的吸光度，以不加培养液的上清液吸光度为对照。每个样品重复3次，取其平均值。
絮凝率=(A-B)/A×100%。
(1)
式中：A———对照的吸光度；
B———加入生物絮凝剂的样品的吸光度。
(4)细菌生长曲线的测定。将筛选的絮凝活性较高的菌株用筛选培养基进行培养，每隔6h取样，以无菌培养基为参比，菌液经无菌培养基适当稀释后，用752分光光度计在660nm处测吸光度值OD660，测定该菌株的生长曲线，同时测定絮凝率。
(5)培养条件试验。对筛选出来的菌株，采用正交试验，选用L9(34)正交表，考察的因子及其水平见表1。
(6)絮凝剂的提取及其性能分析。将菌株X-3的培养液在10000r/min条件下离心15min，去除菌体。在上清液中加入体积比为2∶1左右的4℃无水冰乙醇，振荡至出现白色丝状絮体，离心去上清液，将沉淀物重新溶于水。重复上述操作2次，将析出的物质离心收集、冷冻干燥即得絮凝剂粗品。取絮凝剂粗品0.002g溶于2mL蒸馏水中，采用Molish反应检测絮凝剂中是否含糖，用茚三酮显色反应检测絮凝剂中是否含有蛋白质。
2.结果和讨论
2.1菌株分离纯化与初筛
将采集的样品在培养基上培养，共取得30株纯菌株，并进行编号，见表2。
从结果来看，污泥中微生物包括细菌、放线菌和霉菌，放线菌数量较多。
将所得的纯菌株进行初筛，获得了6株具有较好絮凝性的絮凝剂产生菌，其中细菌3株，放线菌3株。
2.2复筛结果
将初筛具有较好絮凝性的菌株进行复筛，其中絮凝活性最高的一株细菌絮凝率为90.5%，菌株沉降性能好，菌悬液浓度较低，表明该菌株产微生物絮凝剂能力强，且培养液絮凝活性好。因此，以该菌株作为后续研究对象，命名为X-3。
2.3菌株鉴定
从菌株的培养特征、形态特征、生理生化反应等特征进行鉴定，该菌株在牛肉膏蛋白胨平板上菌落呈圆形，边缘不规则，个体较大(见图1)，芽孢中生、不膨大，V-P反应阴性，接触酶阳性。从葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇产酸不产气。革兰氏染色为阳性，为芽孢杆菌属。该菌在筛选培养基下培养的生长曲线和絮凝曲线见图2。由图2可知，该菌生长数量与絮凝率基本上是正相关。该菌生长速率较快，12h后即进入对数生长期，24h进入高峰期，此后缓慢下降，生长速率比此前报道筛选的絮凝剂产生菌快[10-11]。而絮凝率与生长情况类似，因此收获微生物絮凝剂最好的时期是对数生长后期或稳定期。
2.4正交试验
由于絮凝性能和生长状况都是筛选及培养的重要指标，因此，在本试验中，以表征絮凝性能的絮凝率和表征细菌生长的OD值的乘积作为综合评分来评价培养条件。正交试验结果与分析见表3。
从表3可以看出，各因素最高平均综合分的条件分别为pH值为7，葡萄糖质量浓度为10g/L，酵母膏质量浓度为15g/L，温度为20℃，即A2B2C3D1，说明在pH值中性条件下，絮凝率和微生物生长最佳，一定范围内，随着葡萄糖和酵母膏浓度及温度增加，可以提高絮凝率和细菌数量。由极差分析可知，对絮凝率的影响的大小次序为：温度>葡萄糖浓度>酵母膏浓度>pH值。因而培养微生物产生菌时，一定范围内，环境温度对絮凝剂产生和细菌生长影响最大，是最主要的影响因素，葡萄糖投加量次之，pH值影响最小，说明该菌对pH值的适应性较强。由于关键因素对指标影响大，因此必须控制在最佳水平上。考虑到投加的葡萄糖和酵母膏没有被细菌完全利用，在培养基中有部分残留，而且葡萄糖、酵母膏质量浓度为10g/L时，其综合评分降幅不大，在生产上，控制葡萄糖、酵母膏质量浓度为10g/L比较适宜，因此培养X-3菌生产絮凝剂的最佳条件为：温度20℃，葡萄糖质量浓度10g/L，酵母膏质量浓度10g/L，pH值为7。
2.5絮凝剂有效成分的分析
将菌株X-3培养液用1.2节方法
(6)提取微生物絮凝剂，100mL培养液中可提取絮凝剂粗品0.064g(干重)。提取的生物絮凝剂在Molish反应中无明显的糖色反应，而在茚三酮反应中则显示出深紫色，表明该絮凝剂的主要成分是蛋白质。为了进一步了解絮凝剂的结构及性能，将所得絮凝剂提纯并用傅立业红外光谱仪，对样品压片后进行红外光谱测试，见图3。
由图3可以知道，微生物絮凝剂的红外光谱图显示其具有蛋白质特征，在3200～3500cm-1内有强且宽的吸收峰，波峰在3296.8cm-1处，为N—H键伸缩振动，在1020～1220cm-1有一吸收峰，最大吸收波长在1116.1cm-1处，为C—N键伸缩振动，说明絮凝剂中含有—NH2；在2500～3000cm-1处有一中强吸收峰，最大吸收波长在2927.2cm-1处，为O—H键伸缩振动，1653.9cm-1处的吸收峰是C==O伸缩振动形成的，1240.9cm-1处的吸收峰是C—O键伸缩振动形成的，说明絮凝剂中含有—COOH；又因3296.8cm-1处的吸收峰是N—H键伸缩振动形成的，1653.9cm-1处的吸收峰是C==O伸缩振动形成的，说明絮凝剂中含有—CONH。
2.6废水处理试验
为了验证生物絮凝剂对废水的处理效果，在每100mL废水中加入2mL离心X-3菌上清液，以加2mL无菌水的废水为对照，计算絮凝率，结果见表4。由表4可知，X-3产生的生物絮凝剂对印染、皮革、造纸废水、生活污水等均有较好的絮凝沉淀去除效果，特别是皮革废水，絮凝率高达91.6%。
3.结论
(1)从城市污水处理厂活性污泥中分离出1株能产生高效絮凝活性絮凝剂的菌株，命名为X-3，经初步鉴定为芽孢杆菌属。该菌生长较快，12h就进入对数期，絮凝曲线与生长曲线呈正相关。
(2)对X-3所产絮凝剂进行提取，经初步测定絮凝剂主要成分为蛋白质。在一定范围内，环境温度是影响X-3絮凝性能的最主要因素，投加适量葡萄糖可以提高絮凝剂产量，pH值变化对絮凝性能影响不明显。培养X-3菌生产絮凝剂的最佳条件为：温度20℃，葡萄糖质量浓度10g/L，酵母膏质量浓度10g/L，pH值为7。
(3)生物絮凝剂对实际废水絮凝试验表明，X-3所产絮凝剂对印染、皮革、造纸废水、生活污水等均有较好的絮凝沉淀去除效果，具有良好的应用前景。
