1 引言
厌氧消化因能产生生物气(如甲烷和氢气)等能源物质而被广泛运用于污泥稳定和污泥减量过程，其一般包括水解、酸化和甲烷化3个步骤(Boušková et al.,2005).目前，研究人员越来越关注污泥水解和酸化过程中短链脂肪酸(SCFAs)的产生，因其不但可以作为生物脱氮除磷过程中微生物所需的碳源物质(Maurer et al., 1997)，同时还可以作为合成可降解塑料-聚羟基烷酸的原料(Lemos et al., 2006).颗粒有机物的水解是厌氧消化过程的限速步骤(Guo et al., 2007)，低效率的水解会延长消化时间，最终导致工艺负荷降低、运行不稳定和处理费用增加(Gavala et al., 2003)，因此，研发提高污泥水解速率的技术具有重要的意义.
Cadoret等(2002)指出，污泥水解效率除受酶活影响外，还取决于酶表面活性部位在污泥基体中的分布，并提出胞外聚合物(EPS)阻隔降低了酶和底物的接触机会，同时降低了底物的扩散效率，故酶在污泥处理过程中的利用效率不高.研究表明，蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等可以加速污泥的水解，但外源性酶一般被束缚、吸附和隐藏在污泥基体中，从而降低了酶的水解活性(Luo et al., 2011).Wawrzynczyk等(2008)指出，增加酶和底物的接触机会和面积，可以提高污泥的水解效率.EPS是污泥絮体的重要组成部分，主要是由碳水化合物、蛋白质、腐殖酸等组成，污泥中的这些有机物主要是由金属离子通过桥接作用结合在一起的.络合剂具有螯合金属离子的作用，其可以通过络合Ca2+、Mg2+、Fe2+等金属离子破坏污泥的网络结构，从而释放出蛋白质、碳水化合物、腐殖酸等物质，原来被束缚、隐藏于污泥基体中的水解酶也得到释放，水解活性得以表达，从而促进有机物的进一步降解(Wawrzynczyk et al., 2008).
目前，国内外针对络合剂对剩余污泥酶水解的研究已有相关报道，而对于后续酸化过程的基础研究尚鲜有报道.为此，笔者研究了络合剂柠檬酸钠(SC)对剩余污泥酶水解和后续酸化过程的影响，以期为污泥处理技术的研究和实际运用提供借鉴和参考.
2 材料与方法
2.1 实验材料
试验所用剩余污泥取自长沙市第二污水处理厂(国桢污水处理厂)二沉池，污泥先经30 min沉淀，去除上清液，再经0.71 mm的筛网过滤处理去除杂质后，置于4℃的冰箱中保存备用.试验所用污泥基本特性为：pH值6.9，TCOD 8700 mg · L-1，SCOD 100 mg · L-1，TSS 10.2 g · L-1，VSS 6.9 g · L-1，溶解性蛋白质73.0 mg · L-1，溶解性碳水化合物14.2 mg · L-1.
络合剂为二水合柠檬酸钠.酶选用由上海杰辉生物科技有限公司提供的中性蛋白酶、α-淀粉酶2种工业酶，其基本特性分别为：中性蛋白酶酶活5000 U · g-1，最适pH值7.0～7.8，最适温度40～50℃;α-淀粉酶酶活6000 U · g-1，最适pH值5.5～7.5，最适温度50～60 ℃.
2.2 分析项目及方法
TSS/VSS采用重量法测定;COD采用微波密封消解，重铬酸钾法测定，其中，SCOD为离心(转速为10000 r · min-1)10 min后上清液的化学需氧量，TCOD为污泥悬浮液的总化学需氧量;上清液中的蛋白质采用Folin-酚法测定，以牛血清蛋白为标准物;溶解性糖采用苯酚-硫酸法进行测定，以葡萄糖为标准物;NH+4-N采用纳氏试剂分光光度法测定.上清液中的蛋白酶活力采用Folin-酚试剂比色法测定，以牛血清蛋白为标准物;淀粉酶活力采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定(Pin et a1.，1995).
SCFAs采用Agilent 6890N GC型气相色谱仪测定，分析条件为：色谱柱型号DB-FFAP(30 m×0.25 mm×0.25 mm)，检测器为氢火焰检测器FID，载气(N2)流速为2.6 mL · min-1，进样量为1.0 mL，分流比为10∶ 1，进样器温度为250℃，检测器温度为300℃.整个过程采用程序升温，起始炉温为70℃，持续运行3 min，再以20℃ · min-1的速度升温5.5 min，然后在180℃下停留3 min，一个样品的整个运行时间为11.5 min.
污泥经过12 h的真空干燥，随后进行SEM测定(SEM，JSM-6700F，Japan).
2.3 实验方法
SC对污泥酶水解影响：设立2批次实验(每批次包括6个实验组)，各批次均取400 mL污泥，分别投加蛋白酶、淀粉酶0.06 g · g-1(以TS 计，下同)，SC以粉末形式投加，SC的投加量分别为0、0.144、0.288、0.432、0.576、0.864 g · g-1，随后向各锥形瓶中通入氮气约4 min以完全驱除残留空气，加塞置于50℃水浴振荡器上反应，4 h后取样测定水解产物及蛋白酶和淀粉酶的活性，并进行分析.同时设定空白对照组，除不加酶和SC外，其它条件与实验组均相同.
SC对污泥产酸影响：设立4组实验，各组均取400 mL污泥，先投加蛋白酶0.06 g · g-1，SC以粉末形式投加，每组SC的投加量分别为0、0.144、0.432、0.864 g · g-1，随后向各锥形瓶中通入氮气约4 min以完全驱除残留空气，加塞置于50℃水浴振荡器上反应，反应装置在此条件下反应12 d，每天对酸化产物SCFAs进行测定.同时设定空白对照组，除不加酶和SC外，其它条件与实验组均相同.
3 结果与分析
3.1 SC对有机物溶出的影响
原污泥中的溶解性蛋白质和碳水化合物浓度较低(溶解性蛋白质73.0 mg · L-1，溶解性碳水化合物14.2 mg · L-1)，表明其中的有机物主要以固体状态存在，溶解性有机质的含量较低.空白对照组(不加酶也不加SC)反应4 h后，污泥中的溶解性蛋白质和碳水化合物浓度分别增加至400.0和79.0 mg · L-1.在水解酶的作用下，随着污泥胶团的解聚和胞外聚合物的水解，大量有机质由固相转移至液相，成为溶解性物质.图 1为蛋白酶和淀粉酶组实验(均投加酶0.06 g · g-1)在不同SC投加量下(0、0.144、0.288、0.432、0.576、0.864 g · g-1)，反应4 h后污泥中蛋白质和碳水化合物浓度随SC投加量的变化情况.由图可知，只投加水解酶(不投加SC)时，溶解性蛋白质由原污泥的73.0 mg · L-1分别增加至1250.0 mg · L-1(蛋白酶组)和1407.0 mg · L-1(淀粉酶组)，溶解性碳水化合物由原来的14.2 mg · L-1分别增加至244.0 mg · L-1(蛋白酶组)和194.0 mg · L-1(淀粉酶组).污泥的主要成分是蛋白质，此研究中淀粉酶和蛋白酶促进污泥水解的效果差不多，其原因如下：一方面，Pinnekamp(1989)指出，碳水化合物和蛋白质的可生物降解率分别为52.24%和39.70%，蛋白质的可生物降解性较差，其水解在污泥水解过程中是限速步骤.在较短的时间内，碳水化合物的水解效率高于蛋白质.另一方面，EPS中碳水化合物可能与蛋白质相结合，从而形成碳水化合物-碳水化合物、碳水化合物-蛋白质、蛋白质-蛋白质相结合的结构，破坏其中任何一种物质，与其相结合的另一物质也会随之溶解出来(Sesay et al., .，2006).
图 1 污泥中溶解性蛋白质和碳水化合物浓度随SC投加量的变化
投加SC后，溶出的有机物进一步提高，当SC投加量为0.432 g · g-1时，溶解性蛋白质分别增加至2186.0 mg · L-1(蛋白酶组)和2172.0 mg · L-1(淀粉酶组)，溶解性碳水化合物分别增加至433.5 mg · L-1(蛋白酶组)和444.0 mg · L-1(淀粉酶组).污泥是由许多不同的微生物包埋在聚合物组成的网络中形成的，这些聚合物就是EPS(罗琨等，2010)，其主要组成物是蛋白质和碳水化合物(Goel et al., .，1998).EPS的网络结构主要是通过表面带负电荷的基团如COOH-、SO42- 等与金属离子的结合保持其稳定性(Morgan-Sagastume et al., .，2005).SC是一种很强的阳离子络合剂，其能络合EPS中Ca2+、Mg2+等金属离子，从而破坏污泥絮体结构，进而促进蛋白质、碳水化合物和腐殖质等有机物的溶出，并转化为液相中可溶性有机物.
SC的投加量为0～0.432 g · g-1时，溶解性蛋白质和碳水化合物的浓度不断增加，继续提高SC的投加量，其浓度仅有小幅度的上升.由此可知，SC投加量达到一定值后，再通过增加SC的投加量来促进污泥水解的作用并不明显.综合考虑处理效率和经济成本，本研究中SC的最佳投加剂量为0.432 g · g-1.
3.2 SC对水解酶活性的影响
污泥的水解速率主要取决于水解酶的活性，以及污泥中水解酶与底物的接触程度.污泥中原有的及投加的水解酶会被吸附、包埋于污泥基体中，从而降低了水解酶的活性.图 2所示为不同SC投加量下，反应4 h后水解酶活性的变化情况.在一定浓度范围内，随着SC的投加，水解酶活性不断提高，这可能是由于SC的投加促进了水解酶的释放，原来被束缚、隐藏于污泥基体中的水解酶活性得以表达.当SC投加量为0.432 g · g-1时，污泥上清液中的蛋白酶活性由原来的2.25 U · mL-1增加到4.30 U · mL-1，而淀粉酶活性则由4.50 U · mL-1增加到6.99 U · mL-1.继续提高SC的投加量，蛋白酶的活性变化不大，而淀粉酶的活性呈小幅度的下降趋势(SC投加量为0.864 g · g-1时，蛋白酶活性为4.20 U · mL-1，淀粉酶活性下降到6.16 U · mL-1).实验选用的蛋白酶最适pH值为7.0～7.8，淀粉酶最适pH值为5.5～7.5.SC是一种强碱弱酸盐，具有一定的缓冲能力，其溶液具有弱碱性.当SC的投加量为0.432 g · g-1时，蛋白酶组溶液的pH值为7.42，淀粉酶组为7.54(数据图未列出).提高SC的投加量，溶液pH值升高，超出了淀粉酶的最适pH值，从而导致其活性的下降，这也正好解释SC投加量达到一定值(0.432 g · g-1)后，再通过增加SC的投加量来促进污泥水解的作用并不明显.Watson等(2004)的研究也表明，产甲烷反应器中β-葡萄苷酶和蛋白酶的活性随络合剂(硫化物)投加量的增加不断提高，当硫化物的浓度达到600 mg · L-1时，该两种酶活性达最高值.
图 2 污泥中水解酶活性随SC投加量的变化
3.3 SC对氨氮的影响
图 3为反应4 h后，污泥中氨氮浓度随SC投加量的变化情况.在水解酶的催化作用下，污泥中的含氮物质——主要为蛋白质转化为二肽、氨基酸，氨基酸进一步转化为氨(Shanableh et al., .，2001).因此，蛋白质不断溶出的同时，污泥液相中的氨氮浓度也不断提高.只投加水解酶(不投加SC)时，氨氮浓度由原污泥的60.0 mg · L-1分别增加至182.0 mg · L-1(蛋白酶组)和167.0 mg · L-1(淀粉酶组).当SC投加量为0.432 g · g-1时，氨氮浓度分别增加至245.0 mg · L-1(蛋白酶组)和243.0 mg · L-1(淀粉酶组).蛋白质和碳水化合物是剩余污泥的主要组成成分，脂肪含量很少，基本可以忽略.蛋白质的可生化降解性较差，其水解在污泥消化过程中是限速步骤，决定了此过程中有机物的降解程度(刘常青等，2008).SC的投加提高了蛋白质的降解速率，一方面是由于SC的投加促使更多的蛋白质溶解到液相，其降解速率高于固相中的蛋白质.另一方面，SC的投加破坏了EPS的网络结构，水解酶得到释放，从而增加了其与底物的接触机会，蛋白质的转化效率得到提高.
图 3 污泥中氨氮浓度随SC投加量的变化
3.4 SC对污泥产酸的影响
污泥酸化过程中产生的SCFAs与溶解性蛋白质和碳水化合物含量是紧密相关的(Yu et al.,2003)，因此，溶解性有机物越多，产生的SCFAs也越多.图 4为空白(不加酶也不加SC)、蛋白酶(0.06 g · g-1，以TS计，下同)和SC+蛋白酶组(SC 0.144、0.432和0.864 g · g-1，蛋白酶0.06 g · g-1)产生的总SCFAs.由图可知，蛋白酶和SC+蛋白酶组产生的总SCFAs高于空白对照组，最大SCFAs积累量分别达到1499和1788 mg · L-1(以COD计)(SC 0.432 g · g-1)，分别是空白对照组的2.33和2.78倍.SC的投加促使大量固相有机物溶解到液相，同时也增加了污泥中水解酶含量.大分子溶解性有机物，如蛋白质和碳水化合物等在水解酶的作用下得到高效水解，为酸化过程提供了更多的酸化底物，从而导致SCFAs的大量积累.
SC的投加可以减少达到最大SCFAs积累的时间，缩短厌氧消化时间.空白对照组和蛋白酶组的总SCFAs积累量分别在反应第7 d和第6 d达到最大值，而SC+蛋白酶组分别在反应第3 d(SC 0.144 g · g-1)、第2 d(SC 0.432 g · g-1)和第4 d(SC 0.864 g · g-1)就达到了最大值.随后，在SCFAs消耗菌如甲烷菌等的作用下，生成的SCFAs不断被降解.由图 4可知，SC的投加量越大，SCFAs转化降解速率越慢.SC低投加量时(SC 0.144 g · g-1)，SCFAs的浓度随时间下降很快;而SC投加量为0.864 g · g-1时，SCFAs的浓度下降速率趋于平缓.这可能是由于高浓度的SC对产甲烷菌的活性有抑制作用，使SCFAs产生甲烷的途径受到限制，从而降低了SCFAs的转化速率.
图 4 污泥厌氧消化过程中SCFAs的累积量
3.5 SEM图
图 5为污泥经不同处理反应4 h后的SEM图，50 μm扫描电镜下观察各种处理后污泥的微观结构.原污泥主要是以完整的絮体结构为骨架，污泥表面覆盖着一层网状的聚合物，污泥之间被丝状的粘性物质连接着，表面疏松、光滑(图 5a).经水解酶处理后的污泥颗粒变得更细，聚合物组成的网络结构被破坏，出现了细小的絮体(图 5b).经过SC和酶共同处理后的污泥聚合物的网状结构被进一步破坏，连接在污泥絮体间的丝状粘性物质不见了，出现了更为细小的絮状碎片(图 5c).这说明在SC和酶的共同作用下，污泥中占主要成分的絮体物质——EPS的结构被破坏，EPS中的蛋白质和碳水化合物不断溶出，转变为可溶性物质，从而改变了污泥的结构.
图 5 污泥经不同处理后的SEM图 (a.原污泥；b.蛋白酶；c. SC+蛋白酶)
4 结论
1)络合剂SC提高了污泥酶水解和酸化的效率，溶解性蛋白质和碳水化合物浓度大幅度提高，本研究中SC的最佳投加剂量为0.432 g · g-1.
2)络合剂SC可以提高污泥中SCFAs的积累量，同时减少达到最大SCFAs积累的时间，缩短厌氧消化时间.空白对照组和蛋白酶组的总SCFAs积累量分别在反应第7 d和第6 d达到最大值，而SC+蛋白酶组(SC 0.432 g · g-1)在反应第2 d就达到了最大值.
3)SC能够破坏EPS的网络结构，原来被束缚、隐藏于污泥基体中的水解酶得到释放，从而提高了污泥水解速率.
