1 引言
生物柴油，即脂肪酸甲酯具备可再生性、环境友好性(比化石燃料更清洁)及可用于柴油发动机的兼容性等特点，因而极具应用前景.但目前用于生物柴油生产的油脂原料成本较高，一般可占到成本的70%～85%(Haas et al., 2005)，因此，开发并利用成本低廉且易于大规模获得的油脂原料就显得尤为重要.目前，相关研究中提到的替代油料主要包括：非食用作物、动物脂肪、地沟油、微生物油脂和活性污泥.研究表明，污水处理厂废水处理过程中会产生大量的剩余污泥，这些污泥的处理处置成本占到废水处理成本的50%～60%.且当前的剩余污泥处理处置方式主要是焚烧和填埋，这会造成环境污染和土地资源浪费等问题.利用活性污泥作为油料生产制备生物柴油，具有环境友好、成本低廉和原料丰富易得等特点，有着不可忽视的巨大应用潜力.
然而，当前利用活性污泥生产制备生物柴油尚处于研究阶段.利用活性污泥制备生物柴油的方案主要有两种：①直接甲酯化(一步法);②先将活性污泥预处理，提取得到油脂后再进行甲酯化(两步法).Mondala等(2009)的研究表明，在75 ℃使用体积分数5%的硫酸甲醇溶液与干污泥在质量比为12 ∶ 1的条件下，利用一步法可得到最高的生物柴油产量;而Pastore等(2013)则指出，利用两步法制备生物柴油，其产量高于一步法.此外，不同研究在提取油脂过程中采用的细胞破壁方法、油脂萃取溶剂也不尽相同.目前采用的破壁方法主要有菌株自溶法、超声破碎法、高压均浆破碎法、化学破碎法、微波破碎法、冻融法等.而提取溶剂则决定了提取过程的时间、提取物量的大小和种类.Bligh等(1959)提出利用体积比为2 ∶ 1的氯仿-甲醇提取动物组织中的油脂，发现提 取效果极佳，因此，至今仍被用于活性污泥油脂提取则利用体积比为3 ∶ 1 ∶ 1的正己烷-甲醇-丙酮提取活性污泥中的油脂，也取得了较好的效果.活性污泥是由细菌、真菌、原生动物等组成的混合菌群，针对混合菌群采用哪种破壁方法及油脂萃取溶剂最有效还有待研究.
因此，本研究采用4种破壁方法、两种油脂萃取溶剂组合及两种甲酯化方案，分别对活性污泥进行生物柴油制备，考察其对活性污泥制备生物柴油产量及脂肪酸甲酯组分的影响，最终提出适合用于活性污泥制备生物柴油的方法.
2 材料与方法
2.1 实验装置和SBR运行
实验装置采用SBR运行模式的有机玻璃柱(直径6 cm，高100 cm)，有效工作体积为2.4 L.接种污泥取自北京肖家河污水处理厂，反应器初始污泥浓度(MLSS)为3000 mg · L-1.反应器运行周期为72 h，每个周期包含40 min污泥沉降、10 min上清液排出和10 min进水过程，曝气时间为71 h，曝气方式采用鼓风曝气，供气流量为2.0 L · min-1.人工配制含糖废水培养活性污泥，含糖废水中以葡萄糖和氯化铵分别作为碳源和氮源，COD值为3000 mg · L-1，碳氮比为100 ∶ 5，其他营养物质包括：KH2PO4 6.6 mg · L-1，Na2HPO4 20.1 mg · L-1，以及少量微量元素.运行期间加入适量NaHCO3溶液作为缓冲液，保持反应器pH在7.0～8.0，反应器在室温下运行，水温保持在20～22 ℃，污泥主要相关参数详见表 1.实验活性污泥样品全部取于反应器运行约60 h时.
2.2 活性污泥破壁方法
为避免常规预处理步骤中污泥干燥的成本和时间，将活性污泥在5000 r · min-1条件下离心5 min，得到脱水的活性污泥(TSS约为12%)，作为生物柴油生产原材料.称取一定量脱水污泥于105 ℃ 烘干，换算成干重.污泥样品使用不同的方法进行细胞破碎，包括盐酸加热法、盐酸加热超声法、超声法和液氮法(表 2).其中，盐酸加热法和盐酸加热超声法参考王敏(2009)对粘红酵母油脂研究中的酸热法和酸热耦合超声法，并对水浴及超声时间进行了优化.对活性污泥进行超声会产生一定热量，使得温度提高.有研究表明，在不控温的情况下细胞破碎效果更好(Sheng et al., 2012)，因此，本实验没有进行温度控制.所有实验保证3个平行样品.
将1 g经破壁处理的脱水污泥，与22.5 mL体积比为2 ∶ 1的二氯甲烷-甲醇溶液或25 mL体积比为3 ∶ 1 ∶ 1的正己烷-甲醇-丙酮溶液混合，混合液于室温下150 r · min-1振摇30 min，然后5000 r · min-1离心15 min.取二氯甲烷层或正己烷层置于50 ℃的水浴锅加热至恒重，采用重量法测定脂类提取物总量.然后向提取物中加入5 mL甲醇和0.25 mL浓硫酸，75 ℃恒温水浴1.5 h.加入5 mL饱和的NaCl溶液，并用15 mL正己烷萃取3次，加入5 mL质量体积比为20 g · L-1的碳酸氢钠中和酸性及适量无水硫酸钠脱水，取正己烷层在80 ℃条件下蒸干，得到黄色透明粘稠液体，即为FAMEs，采用重量法进行总量测定，然后对其进行GC-MS组分分析.
2.4 制备生物柴油一步法
向经破壁处理的4 g脱水污泥中加入30 mL甲醇和1.5 mL浓硫酸，75 ℃恒温水浴7 h使反应完全.加入5 mL饱和NaCl溶液，用30 mL正己烷萃取3次，加入10 mL 20 g · L-1的碳酸氢钠中和酸性及适量无水硫酸钠脱水，取正己烷层在80 ℃条件下蒸干，采用重量法进行FAMEs总量测定，然后对其进行GC-MS组分分析.一步法中的普通法，即不采取任何破壁手段，直接进行甲酯化处理.
2.5 FAMEs组分分析
所有FAMEs样品于-20 ℃冷冻保存.将样品用适量正己烷溶解，0.45 μm PTFE膜过滤，利用配有质谱仪的Varian 4000气相色谱仪进行分析.色谱条件：色谱柱为30 m×0.250 mm×0.25 μm Agilent J&W DB-5MS UI毛细管柱，升温程序设定为以10 ℃ · min-1从70 ℃提高到130 ℃，以4 ℃ · min-1从130 ℃提高到200 ℃，以3 ℃ · min-1从200 ℃升至220 ℃，最后以5 ℃ · min-1从220 ℃升至270 ℃，并保持2 min，进样口温度设定为270 ℃，载气为高纯氮气，柱流量为1 mL · min-1，分流比为20 ∶ 1.质谱条件：电离方式为电子轰击，电子能量为70 eV，离子源温度200 ℃，倍增器电压2000 V，扫描范围50～400 amu.利用14种C8～C24的FAME混标(18918-1AMP，Sigma-Aldrich，美国)对具体组分进行定性分析.
3 结果与讨论
3.1 破壁方法对两步法制备生物柴油的影响
由于细菌积累的油脂主要集中于胞内，因此，破坏细胞壁是一个关键的步骤.本实验分别采用盐酸加热法、盐酸加热超声法、超声法和液氮法对活性污泥进行破壁处理，然后进行油脂提取和甲酯化反应.两步法脂类提取物产量如图 1 a所示，以二氯甲烷-甲醇为油脂提取溶剂时，4种破壁方法中，盐酸加热法和盐酸加热超声法每克干泥所得脂类提取物质量最多，产量分别为(117.3±1.8)、(107.2±1.1)mg · g-1，效果最佳.超声法效果较差，脂类提取物产量为(57.6±3.7)mg · g-1，约为上述两种方法所得量的50%.液氮法效果最差，脂类提取物产量为(29.4±3.2)mg · g-1，与其他方法差距明显.以正己烷-甲醇-丙酮为油脂提取溶剂时，盐酸加热法、盐酸加热超声法和超声法的效果差别不大，脂类提取物产量分别为(53.2±2.0)、(48.5±3.1)、(47.1±4.0)mg · g-1.液氮法的效果依然最差，脂类提取物产量仅为(23.3±1.8)mg · g-1.结果表明，盐酸加热超声法中超声的效果并不明显，此方法中超声功率为200 W，主要用来促进盐酸破壁和油脂溶解，与超声法1000 W的目的不同.盐酸加热法主要利用盐酸对细胞壁中糖及蛋白质等成分的作用，使原来结构紧密的细胞壁变得松散，再经沸水浴及速冷处理，使细胞壁进一步被破坏，破碎效果好.超声法主要利用其对媒介产生的机械振动作用和空化作用达到细胞破碎的目的，但可能由于能量分布不均，功率不足等原因，破壁效果不如预期.液氮法对粘红酵母的破壁效果较好，但可能由于活性污泥具有菌胶团结构，冷冻破壁效果不明显.综上，在两步法的破壁阶段，盐酸加热法破壁效果最好，超声法其次，液氮法最差.
图 1 两步法不同破壁方法每克干泥对应脂类提取物质量(a)及FAMEs质量(b)
甲酯化后所得FAMEs产量如图 1 b所示，可以看出，只有一部分脂类提取物被甲酯化，与其他文献(Dufreche et al.， 2007; Mondala et al.， 2009)结果类似，原因可能是提取物中含有其他不参与甲酯化的脂类物质.所得FAMEs产量基本与脂类提取物产量成正比，其中，盐酸加热法(二氯甲烷提取：(60.4±3.5)mg · g-1，正己烷提取：(45.5±3.2)mg · g-1)与盐酸加热超声法(二氯甲烷提取：(53.2±0.3)mg · g-1，正己烷提取：(43.3±4.1)mg · g-1)有较明显的优势，超声法其次(二氯甲烷提取：(42.7±2.5)mg · g-1，正己烷提取：(38.2±3.9)mg · g-1)，液氮法甲酯化后产量依然很低(二氯甲烷提取：(22.4±4.4)mg · g-1，正己烷提取：(27.3±2.2)mg · g-1).
通过GC-MS分析，两步法所得FAMEs产物组成成分如表 3所示.盐酸加热法、盐酸加热超声法和超声法所得成分基本相同，共13种，其中，含量较高的包括12-甲基十四烷酸甲酯、14-甲基十五烷酸甲酯、棕榈油酸甲酯(C16 ∶ 1)、棕榈酸甲酯(C16 ∶ 0)和油酸甲酯(C18 ∶ 1).超声法所得C18 ∶ 0和C16 ∶ 0两种脂肪酸甲酯含量较其他方法偏高，原因可能是高能量的超声波对油脂有一定的破坏作用，促进细菌 细胞偏外侧的油脂生成游离脂肪酸从而提高了FAMEs的转化率.液氮法所得FAMEs含量和种类都很少，表明该方法并不适用于活性污泥细胞壁破碎.在同类研究中所得生物柴油成分多集中于C16～C18，没有出现过带支链的FAMEs(Dufreche et al., 2007; Mondala et al., 2009; Revellame et al., 2012)，而细菌脂肪酸(尤其是革兰氏阳性菌)的特点就是很少有双键但常被羟化或者含有支链(Sasser，1990)，当细菌处于低温环境时，细胞膜上的脂肪酸不饱和度会增加，从而增加其低温流动性.
3.2 油脂提取溶剂对两步法制备生物柴油的影响
如图 1a所示，相比于正己烷-甲醇-丙酮，甲醇-二氯甲烷能够得到更多的脂类提取物，且甲酯化反应后可得到更多生物柴油.采用甲醇-二氯甲烷提取油脂，最高可获得(60.4±3.5)mg · g-1 的FAMEs，而采用正己烷-甲醇-丙酮溶剂，FAMEs的最高产量为(45.5±3.2)mg · g-1.FAMEs产量与总脂类提取物的比值如图 2所示，采用二氯甲烷提取，破壁方法为盐酸加热法和盐酸加热超声法的比值在0.5左右，超声法和液氮法的比值在0.75左右，而正己烷提取的方法比值均在0.8以上.结果表明，二氯甲烷提取到了更多无法被甲酯化的物质.有研究表明(Revellame et al., 2012)，采用甲醇-二氯甲烷溶剂不仅从活性污泥中提取到用于生产FAMEs的脂类物质，还能提取出其他高附加值产物，如聚羟基脂肪酸酯(PHAs).该物质是一种天然的高分子生物材料，具有良好的生物相容性能、生物可降解性和塑料的热加工性能，可作为生物医用材料和生物可降解包装材料，但目前其相对于传统塑料的高价格束缚了它的应用领域.在实际应用中，如果只是单纯制备FAMEs，可以考虑采用正己烷-甲醇-丙酮油脂提取溶剂;如果采用甲醇-二氯甲烷油脂提取溶剂，不仅能保证FAMEs的制备，还可能提取制备出多种高附加值产物.
图 2 FAMEs产量与脂类提取物产量比值
在FAMEs成分上，两种溶剂组合没有明显差异(表 3).组分中都包括以下带甲基支链的脂肪酸甲酯：9-甲基十四烷酸甲酯、12-甲基十三烷酸甲酯、12-甲基十四烷酸甲酯、14-甲基十五烷酸甲酯、14-甲基十六烷酸甲酯;不饱和脂肪酸甲酯：棕榈油酸甲酯(C16 ∶ 1)和油酸甲酯(C18 ∶ 1).只是在采用液氮冷冻破壁的情况下，相对于甲醇-二氯甲烷，正己烷-甲醇-丙酮提取油脂使其甲酯化后，无法检测到9-甲基十四烷酸甲酯、油酸甲酯(C18 ∶ 1)及硬脂酸甲酯(C18 ∶ 0).Knothe(2005)对生物柴油的研究中指出，生物柴油一般低温流动性差，低温容易结晶，堵塞过滤器，导致不能从油箱泵送到发动机，造成无法启动，严重制约了生物柴油的使用，而脂肪酸甲酯中双键和支链数目的增加，能够增大分子间距，在一定程度上增加其低温流动性，但不饱和键过多会导致生物柴油的抗氧化能力变弱.
3.3 破壁方法对一步法制备生物柴油的影响
一步法每克干泥所得FAMEs质量如图 3所示，一步法中超声法产量最高，FAMEs产量为(45.5±3.2)mg · g-1，普通法其次，FAMEs产量为(40.7±0.7)mg · g-1，盐酸法和盐酸超声法产量较低，分别为(29.8±4.3)mg · g-1和(33.4±2.6)mg · g-1，液氮法最低，产量为(27.2±4.2)mg · g-1.在一步法中，硫酸是关键的因素，它不但是酯化反应的催化剂，而且可以将一些脂肪酸盐转化为脂肪酸参与酯化反应，同时硫酸有很好的破坏细胞壁效果，本实验中用到的体积比为5%的硫酸-甲醇在同类实验中属于较高的浓度，可兼顾破壁和甲酯化反应，因此，普通法也可以得到比较高的脂肪酸甲酯产量.Pastore等(2013)的研究表明，在甲酯化反应中，在一定范围内硫酸的浓度越高，得到的脂肪酸甲酯的量也就越大.实验结果表明，超声法有助于提高产量，而盐酸法和盐酸超声法反而降低了脂肪酸甲酯的产量.这很可能是因为酯化反应为可逆反应，盐酸含有较多的水，促使甲酯化反应向相反方向移动，即水会和甘油酯或脂肪酸甲酯反应生成游离脂肪酸，降低脂肪酸甲酯产率.因此，尽管盐酸法和盐酸超声法有比较强的破壁效果，但并不适用于一步法.
图 3 一步法不同破壁方法每克干泥对应的FAMEs质量
一步法脂肪酸甲酯产物组成如表 4所示，几种破壁方法的甲酯化产物组成基本一致，同样出现了上述5种含有甲基支链的脂肪酸甲酯及2种单不饱和脂肪酸甲酯.但在没有破壁处理的酯化反应后，没有检测到12-甲基十三烷酸甲酯，而采用盐酸加热超声法和液氮法破壁后，则无法检测到硬脂酸甲酯(C18 ∶ 0).总体而言，在成分上与采用盐酸加热或盐酸加热超声破壁的两步法基本一致.
3.4 甲酯化方案对生物柴油制备的影响
对一步法和两步法中脂肪酸甲酯产量最高的两种制备方法(即超声一步法和盐酸破壁配合甲醇-二氯甲烷提取两步法)进行比较，盐酸破壁配合甲醇-二氯甲烷提取两步法可以得(60.4±3.5)mg · g-1生物柴油，超声一步法可以得到(45.5±3.2)mg · g-1生物柴油，两步法产量明显高于一步法，在脂肪酸甲酯组成上两种方法没有明显差别.盐酸破壁配合甲醇-二氯甲烷提取这种方法在制备生物柴油量上有明显优势，而超声一步法虽然产量稍低，但制备步骤相对简单，所用化学试剂较少，也不失为一种实用且相对环境友好的生物柴油制备方法.在实际工程应用中应根据具体情况，综合考虑各种因素，选取最适合的剩余污泥制备生物柴油方法.
4 结论
1)制备生物柴油两步法中采用盐酸加热破壁的效果最好，而制备生物柴油一步法则是采用超声破壁的产量最高.
2)采用甲醇-二氯甲烷溶剂提取油脂，相比正己烷-甲醇-丙酮溶剂能够得到更多脂类物质及较高的生物柴油产量.
3)盐酸破壁配合甲醇-二氯甲烷提取的两步法在制备生物柴油产量上有明显优势，超声破壁一步法虽产量偏低，但因其步骤简单，化学试剂用量少，在大规模生产中也有很好的应用价值.
4)不同的甲酯化方案对脂肪酸甲酯成分的影响不大，出现的带支链的细菌脂肪酸甲酯和不饱和脂肪酸甲酯很可能对改善生物柴油的低温流动性有一定的意义.
