微生物絮凝剂具有易生物降解，适用范围广，热稳定性强，用量小，无二次污染等优点[1，2]，与传统的无机与有机高分子絮凝剂相比具有更广泛的应用前景。但微生物絮凝剂目前存在生产条件较复杂，成本偏高等不足之处，其研究尚处于实验室阶段。如何降低微生物絮凝剂成本，成为研究的热点。豆腐废水又名黄泔水，含有丰富的碳源和氮源[3，4]。尽管豆腐渣资源化的报道也不少，但国内外鲜见用豆腐废水培养并制备生物絮凝剂的报道。豆腐废水作为廉价材料培养制备微生物絮凝剂可以大大降低它的成本，这是豆腐废水资源化的一种新途径。
1 材料与方法
11 实验材料与实验仪器
111 菌种
从广州市猎德污水处理厂曝气池的活性污泥中筛选分离得到。
112 培养基1)分离培养基：葡萄糖20g/L，酵母浸粉2g/L，蛋白胨2g/L，MgSO401g/L，KH2PO405g/L，琼脂17g/L，pH=65。2)种子培养基：马铃薯200g/L(煮后取滤液)，葡萄糖20g/L，K2HPO405g/L，pH=70～72。
113 豆腐废水采集于学校豆制品厂。取回的豆腐废水经纱布过滤，用于菌株的廉价培养。
114 实验仪器KDC160HR高速冷冻离心机，科大创新股份有限公司中佳公司；TGL16H离心机，HEMACo.Ltd；BSIEA振荡培养箱，国华企业；PHSJ3F型实验室pH计，上海精密科学仪器有限公司；HH数显恒温水浴锅，江苏金坛市宏华仪器厂；STZA24型浊度仪，无锡市光明浊度仪厂。
12 方法
121 菌种的筛选和分离纯化活性污泥经稀释后涂布于分离培养基上，28℃培养2～3d。挑出生长较快，荚膜较厚，有光泽和湿润程度适中的菌落进行再分离。将分离得到的菌株接种到液体发酵培养基中，置于摇床培养箱中(转速160r/min，30℃)培养48h后检测发酵液的絮凝活性，选择絮凝效果较好的菌株进行复筛。
122 豆腐废水水质的测定方法BOD5采用稀释接种法；CODCr采用重铬酸钾法；氨氮采用纳氏试剂比色法；还原糖采用高锰酸钾滴定法；悬浮物(SS)采用重量法。
123 絮凝活性测定方法
称取4g高岭土(平均粒度4μm)加入到1000mL蒸馏水中，放置过夜，测前搅拌均匀。测定时在每个250mL烧杯中加入200mL高岭土悬浊液，置于六联式搅拌机上搅拌均匀后加入12mL上清液。搅拌先快后慢，搅拌完成后静置5min。用STZA24型浊度仪测静置后溶液的浊度。絮凝率表征絮凝活性，以不加微生物絮凝剂的高岭土悬浮液的浊度为空白对照，计算公式为：
絮凝率=[(A-B)/A]×100%
式中 A为空白对照的浊度值；B为加入絮凝活性物质后浊度值。
2 结果与讨论
21 豆腐废水水质分析
从豆腐废水水质表(见表1)可以看出，废水中含有丰富的碳源和氮源。用豆腐废水作廉价培养基培养并制备微生物絮凝剂，可以大大降低生物絮凝剂的成本，豆腐废水因此得到资源化。
22 初筛与复筛经絮凝活性测试，有87菌株存在不同程度的絮凝活性。以絮凝矾花大小、沉降快慢和静置5min后溶液的澄清度为指标，有6株效果较好。选其中1株作为本文的研究对象，经镜检及生理生化实验表明，该菌株为酵母属(Saccharomycessp)。
23 微生物絮凝剂的最佳产生条件确定
选择影响微生物絮凝活性较大的4因素(豆腐废水体积分数、培养温度、摇床速度和初始pH值)进行实验，以絮凝率为质量控制指标。4因素3水平正交实验设计见表2。由表2可知，各因素影响微生物絮凝剂产生大小排序为：豆腐废水含量，初始pH值，温度，摇床速度。以自来水为稀豆腐废水的稀释水，豆腐废水体积分数越高，发酵液的渗透压越大。培养液的渗透压超过某一值时，高效絮凝菌分泌絮凝活性物质的能力受到抑制。相反，豆腐废水体积分数太低，营养物质太少也不能满足高效菌的生长需要，所以豆腐废水体积分数太高或太低均不利于絮凝活性物质的产生。发酵液的初始pH值不同，微生物的长势也明显不一样。酸能够抑制或刺激微生物分泌絮凝剂，偏酸或偏碱环境均不利于生物絮凝剂的产生。用豆腐废水作替代培养基培养该菌株的最优方案是：豆腐废水体积分数25%，初始pH值50，温度30℃，摇床速度160r/min。以下实验均采用正交实验的最优条件为菌株的培养条件。
24 絮凝菌株生长曲线与絮凝活性的关系
该菌在对数生长期前期繁殖迅速(见图1)，但此时发酵液的絮凝活性较低；24～36h期间，絮凝活性提高较快。可见絮凝活性物质是菌株生长到一定时间后才产生的。36h以后生物量趋于稳定，菌株生长进入稳定期，絮凝活性物质仍增加较快；48h菌生长量达到最大，菌株产絮凝活性也达到最大，pH值维持在4左右；48h以后菌体进入内源呼吸期，活细胞数目逐渐减少，发酵液的絮凝活性亦有降低的趋势。这说明48h是收获微生物絮凝剂的最佳时间。
25 摇瓶装量及添加不同碳源对絮凝活性的影响
在相同灭菌和培养48h条件下，1L三角锥瓶中分别装入125mL，250mL，500mL体积分数为25%的豆腐废水，在不同装量豆腐废水中加入相同浓度不同类型的碳源。结果表明，相同容积发酵液的体积越少，絮凝率越高。这是因为菌株为好氧菌，摇瓶装量越少，单位体积发酵液中溶解氧越多，絮凝活性物质产量越大。相同浓度碳源的类型不同，絮凝活性物质产量也不同。蔗糖更有利于絮凝活性物质的产生，但与未加碳源的对照发酵液比较，无明显提高。这说明体积分数为25%的豆腐废水中营养成分基本适合菌株的生长要求，酒精和淀粉的添入反而抑制了高效菌絮凝活性物质的产生。
26 不同离心转速、金属离子对絮凝率的影响
发酵液经不同离心速度离心后分层，上层液基本澄清，下层为菌体。以高岭土悬浊液为絮凝对象，发酵液上清液的投加量为6mL/L，离心后菌体湿重投加量为6g/L，絮凝率见图3。由图3可知，上清液絮凝活性大，而菌体絮凝活性小。这说明引起絮凝的活性物质是菌株在发酵过程中分泌出的胞外物质，而非菌体本身。胞外物质不是微生物细胞自溶所致。离心速度的增大使得发酵液中粘附在菌体本身的絮凝活性物质与菌体分离逐渐完全，上清液的活性物质增多，絮凝率相应提高。当离心速度达到某一定值后，离心力使一部分絮凝活性物质沉降下来，发酵液的上清液絮凝率降低，菌体的絮凝率升高。这也进一步证明絮凝活性物质是胞外分泌物，与文献报道相吻合。
金属离子对絮凝活性的影响实验中，为突出金属离子的助凝作用，每200mL高岭土悬浊液中只投加08mL发酵液的上清液，然后分别投加相同质量浓度(10g/L)而不同体积的不同金属离子溶液，实验结果见图4。由图4可知，Ca(Ⅱ)、Mg(Ⅱ)、K(Ⅰ)和Fe(Ⅱ)对生物絮凝剂都有一定的助凝作用。但Fe(Ⅱ)增加了色度，不宜做助凝剂；其他3种金属离子中，Ca(Ⅱ)的助凝效果最好，最佳投加量为100mL高岭土悬浊液中投加2mLCaCl2溶液。但随着金属离子溶液体积的增加，絮凝率反而有下降的趋势，这是因为多余的金属离子抑制了絮凝活性物质的絮凝。
27 温度、pH值对絮凝剂活性的影响
发酵液的上清液和待处理的高岭土悬浊液置于烧杯，在不同的温度下水浴10min，使得烧杯内溶液温度均匀，然后进行微生物絮凝剂的活性测试，实验结果见图5。由图5可知，絮凝率随温度升高而升高，温度在60℃处絮凝率达到最高。这是因为溶液中絮凝活性物质与高岭土悬浊颗粒的运动速度随着温度升高而加快，它们之间的碰撞机也相应增大，悬浊颗粒在絮凝活性物质的作用下迅速形成大的矾花沉降下来，溶液上层变得澄清。但随着温度继续升高，絮凝率反而降低。这是因为絮凝活性物质是由多糖和蛋白质组成，当温度达到一定值时，蛋白质变性失活，絮凝活性物质只有多糖起作用，絮凝率恒定在某一值，微生物絮凝剂因此表现出较好的热稳定性。
含絮凝活性物质的发酵液对某工业区河道河冲废水的实际应用中，废水pH值在1～12的范围内，发酵液均表现出较高的絮凝活性，尤其是在偏酸或碱性环境下，絮凝效果更好(见图6)。试验现象原因是，胶体在酸性或碱性溶液中处于不稳定状态，颗粒间的作用力比中性条件下更容易被破坏。胶体和絮凝活性物质作用迅速脱稳，凝聚沉降，这同时说明微生物絮凝剂在不同pH值的废水中表现出较强的应用性。
3 结 论
1)从污水处理厂曝气池污泥中分离出87株菌，选出其中1株絮凝活性较高的酵母属(Saccharomycessp)菌株作本实验对象。
2)各因素影响微生物絮凝剂活性大小排序为：豆腐废水体积分数，初始pH值，温度，摇床速度。
3)高效絮凝菌株的最优培养条件是：豆腐废水体积分数25%，初始pH值50，温度30℃，摇床速度160r/min；3)微生物絮凝剂是胞外分泌物，对酸性和碱性废水有较好的适应性和热稳定性。
4)金属离子对微生物絮凝剂有助凝作用，Ca2+的助凝效果较好。
5)豆腐废水作为廉价材料培养制备微生物絮凝剂可以大大降低微生物絮凝剂的成本。这是豆腐废水资源化的一种新途径。
