谢 珊 刘俊新 李 琳 乔传令
(1.中国科学院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室，北京100085；2.中国科学院动物研究所虫鼠害综合治理研究国家重点实验室，北京100101)
摘 要 研究了悬浮状态和固定化状态的基因工程菌BL21对有机磷混合农药废水的降解特性。工程菌能快速、高效地降解有机磷混合农药，其最适底物是对硫磷，而马拉硫磷不能被工程菌降解。不同农药降解速率的差别造成了不同有机磷农药的降解过程需要用不同的动力学模型来描述。比较固定化状态和悬浮状态的工程菌的降解效果可知，固定化工程菌的降解活性较后者明显降低，其比降解速率大约仅为后者的20%。考察固定化工程菌长期运行的效果，发现其降解活性保存良好，工程菌稳定性大大提高，未出现固定化细胞溶涨、破碎现象。固定化后，工程菌的比降解速率虽然比悬浮工程菌降低了，但固定化工程菌更适用于长期运行的废水处理系统。
有机磷农药是目前使用最广泛的杀虫剂之一，在农药市场中占有重要的地位。然而，在有机磷农药生产和使用过程中产生的含有机磷农药的废水，具有浓度高、毒性大、成分复杂的特点，如处理不当，会造成严重的环境污染。因此，有机磷农药废水的处理已受到关注，研究废水中有机磷农药物质的高效降解技术具有广泛的应用价值。
生物技术是处理有机磷农药废水的主要方法之一，已有研究表明，自然环境中的某些细菌、真菌、放线菌和藻类等均对有机磷农药具有降解作用。
然而，直接从环境中筛选有机磷农药降解菌，其筛选过程费时费力，并且在环境中受土著菌的影响较难成为优势菌。近年来，随着生物工程技术的发展，国内外研究者开始构建具有超强降解能力的基因工程菌，强化有机磷的降解。Mulchandani等构造了表面表达有机磷水解酶(OPH)的基因工程菌；Walker等构造了一株同时表达OPH酶和PNP降解酶的工程菌，该菌能利用对硫磷作为碳源和能源生长；Gilbert等将2种基因工程菌共固定于生物膜表面，实现了微生物菌群的共同生长和目标污染物对硫磷的彻底矿化。众多研究表明，工程菌的降解活性明显高于野生菌株，成为了去除有机磷污染物的有力工具。
为了防止工程菌在使用过程中流失导致去除效果的下降，在实际废水处理中通常采用固定化的方式。固定化过程不仅可以保护工程菌抵御恶劣的自然环境(如极端pH值、温度)、有毒物质和土著微生物竞争作用，而且，还能提高工程菌的生物稳定性和质粒稳定性[8～10]。聚乙烯醇(PVA)凝胶作为固定化载体中的一种，具有空隙率高、机械强度高、热稳定性能好、耐酸、碱性以及含盐类的环境，以及无生物毒害作用的优点[11，12]，因此非常适合于废水处理。
本实验研究了基因工程菌对农药废水中有机磷混合农药的降解特性，分析了对不同农药的降解动力学，比较了悬浮状态和固定状态工程菌的降解效果，并进一步考察了固定化菌长期运行的稳定性。
1 材料与方法
1.1 实验用菌种
基因工程菌(E.coliBL21/pET-opd-b1)由中国科学院动物研究所虫鼠害综合治理国家重点实验室构建，工程菌的表达载体为EscherichiacoliBL21，质粒载体为pETDue，t该工程菌能同时表达有机磷水解酶(OPH)和羧酸酯酶(B1)，其培养方法参考相关文献。
1.2 实验废水
实验废水由敌敌畏、甲基对硫磷、马拉硫磷、对硫磷和丙溴磷5种农药配制而成，废水中每种农药的浓度均为40mg/L，混合农药总浓度为200mg/L。为了保证模拟废水的pH值为中性(pH7.2)，每升废水中加入6gNaH2PO4和6.6gNa2HPO4。有机磷农药由中国科学院动物研究所提供，农药标准品(纯度≥99%)购于国家标准物质中心。
1.3 工程菌的固定化方法
将工程菌细胞和PVA胶体混合，多次“冷冻-解冻"，制得固定化PVA凝胶，将PVA凝胶剪碎成1～2mm的颗粒状，得固定化细胞。工程菌的固定化过程参见文献。PVA粉末购于国药集团化学试剂有限公司，平均聚合度为1750±50。
1.4 悬浮状态和固定化状态的工程菌处理混合农药废水研究
采用批量实验考察悬浮状态的工程菌对废水中有机磷混合农药的降解效果。在三角瓶中加入混合农药废水、离心后的工程菌以及1%的甲醇(确保农药完全溶解)，37℃、150r/min摇床培养。工程菌浓度为0.64g/L。每组实验做2个平行，以不接菌的摇瓶作为对照。
固定化工程菌对混合农药的降解实验也在三角瓶中完成，分别加入30mL混合农药废水、5g固定化细胞以及1%的甲醇(确保农药完全溶解)，37℃、150r/min摇床培养。不同时间取2mL水样分析水中残留的混合农药浓度，并以不接菌的摇瓶为对照。采用多次批量实验考察了固定化状态的工程菌降解有机磷混合农药废水的长期处理效果。以24h为周期，每个周期结束后，更换新的混合农药废水和甲醇，维持反应体系中总体积不变，如此反复，整个降解实验进行了50d。
1.5 分析项目与方法
含有机磷农药的水样经乙酸乙酯萃取后，用HP-6890气相色谱仪分析。检测器为氮磷检测器(NPD检测器)，色谱柱为HP-5毛细管柱(30.0m×320μm×0.25μm)。氮气作为载气，流量为1mL/min。进样口温度为240℃，检测器温度为250℃，柱温为120℃开始，20℃/min升温至200℃，再2℃/min升温至220℃，20℃/min升温至240℃，保留2.5min。敌敌畏、甲基对硫磷、马拉硫磷、对硫磷和丙溴磷的出峰时间分别为4.213、10.798、12.036、12.602和16.184min。固定化工程菌的微观结构用扫描电镜(Quanta200，FEI，USA)观察，电镜样品的具体制样过程参见文献。
2 结果与讨论
2.1 工程菌的形态特征
图1为悬浮状态工程菌(图a)、固定化状态工程菌包埋初期(图b)和连续运行50d之后(图c)的电镜图片。在悬浮状态下，工程菌细胞均匀分布在废水中，保证了细胞与底物之间的充分接触和传质。
而固定化状态下，PVA冷冻凝胶的表面和内部，有很多尺寸不一的微孔，工程菌细胞被包埋在微孔之中，在一定程度上阻碍了细胞与底物的接触和传质作用。但另一方面，固定化载体为细胞的附着提供了骨架，细胞在微孔内聚合成团状，能较好地抵御水力冲刷。固定化状态的工程菌在连续运行50d后，载体内部的工程菌由于得不到足够的营养物质而逐渐干瘪、死亡，数量也逐渐减少，而表面的工程菌生长良好，仍能观察到数量较多、形态饱满的活菌存在。与海藻酸钙、卡拉胶、琼脂等固定化载体相比，PVA凝胶更加能够耐受和抵御恶劣环境的不良影响，避免固定化载体的解体或破碎，固定化PVA细胞能够稳定运行6个月甚至1年以上[11，15]。
2.2 悬浮状态的工程菌BL21对混合农药的降解
图2为悬浮状态的工程菌BL21对混合农药废水的降解效果。如图所示，10min时，工程菌BL21对对硫磷和甲基对硫磷的降解率高达98%，对敌敌畏和丙溴磷的降解率分别为88%和75%；60min后，对敌敌畏和丙溴磷的降解率提高到95%和91%，但对马拉硫磷基本没有降解作用。当混合农药浓度提高到1000mg/L，降解时间为5h时，工程菌对对硫磷的降解率始终保持在100%，而此时甲基对硫磷、敌敌畏和丙溴磷的去除率都有不同程度的下降，降解率在40%～60%之间(图3)。总体而言，工程菌能快速、高效地降解除马拉硫磷以外的有机磷混合农药。
工程菌BL21中含有2种功能基因opd和b1，它们分别能够表达有机磷水解酶OPH和羧酸酯酶B1，这2种酶都能参与有机磷的降解和解毒过程，但它们所起的作用是不同的[16，17]：OPH酶可以断裂磷酸三酯键，水解有机磷；而B1酶不能水解有机磷，它只能与有机磷分子不可逆结合，B1酶不能重复使用。OPH酶水解有机磷的能力比B1酶强很多，这是因为1mol羧酸酯酶只能与1mol有机磷分子不可逆结合，而1mol有机磷水解酶则可水解多摩尔有机磷分子，且水解速率相当高。OPH酶的降解域很广泛，对不同有机磷农药的降解能力差别也较大，其降解能力的发挥与OPH酶的活性位点和底物结合的难易程度密切相关，其最适底物为对氧磷。另外，OPH酶的水解能力受很多环境因素，如底物分子结构、二价金属离子、螯合物(EDTA)的影响[16，18]。在本实验采用的5种有机磷农药中，工程菌BL21的最佳底物为对硫磷。
2.3 悬浮状态的工程菌降解有机磷混合农药的动力学分析
底物降解的动力学方程主要有：零级反应动力学方程、一级反应动力学方程、米-门方程(Michaelis-Menten方程)、Haldane方程(描述底物抑制作用下的降解反应动力学)等。分析混合有机磷农药的比降解速率可以发现，不同农药的比降解速率呈现不同的变化规律(图4)，需要用不同的动力学模型来描述。甲基对硫磷的比降解速率随农药浓度的提高呈现明显的先增加后降低的趋势，其降解过程符合底物抑制动力学，可用Haldane方程(公式1)来表述；敌敌畏和丙溴磷的比降解速率随农药浓度的提高逐渐增加并趋于稳定，这2种农药的降解过程动力学可以用米-门方程来表述(公式2)；对硫磷的比降解速率随着浓度的增加而增加，可以用零级反应动力学方程来表述(方程3)。
混合农药废水中不同农药的降解过程需要用不同的动力学模型来模拟，分析其原因，是由于工程菌对不同农药的降解能力差别很大，对对硫磷的去除能力远胜过其他3种农药(图3)，当单一农药浓度均为200mg/L时，敌敌畏和丙溴磷的比降解速率已经达到饱和，甲基对硫磷甚至因农药浓度过高出现了底物抑制的现象，而工程菌对对硫磷的降解能力还未完全发挥，因此出现了不同农药的比降解速率曲线趋势不同的现象。
2.4 工程菌包埋量优化与载体对混合农药的吸附作用
考察了不同细胞包埋量下，固定化工程菌对混合有机磷农药废水的降解情况，结果如图5所示。降解时间为20min。随着包埋量的增加，有机磷对混合农药废水的降解率(除马拉硫磷外)也逐渐增加，当包埋量为0.012～0.017g干细胞/gPVA时，降解率达到峰值。因此将包埋量选定为0.012g干细胞/gPVA。通过计算，包埋量为0.012g干细胞/gPVA时，工程菌密度为2.0g干细胞/L。
以工程菌包埋量为0的PVA载体为空白样，结果表明，PVA对混合农药具有吸附作用，但对不同农药的吸附效果差别较大(图5)。PVA载体对丙溴磷的吸附作用最强，达到了22%，对其余4种农药的吸附作用都较微弱。吸附作用的强弱与农药的溶解度密切相关，虽然在实验中加入了1%的甲醇促进农药溶解，但不同农药溶解度的差异会造成载体对不同农药吸附能力的差别，溶解度低的农药，载体的吸附作用就比较强。丙溴磷在水中的溶解度仅为20mg/L，因此其吸附作用就较强。图5中马拉硫磷有5%左右的去除，就是PVA载体对马拉硫磷吸附作用的结果。
2.5 固定化工程菌对混合农药的降解
图6是固定化工程菌对废水中有机磷混合农药的降解情况。对比图6和图2可知，尽管固定工程菌的菌密度为2.0g干细胞/L，而悬浮工程菌的菌密度为0.64g干细胞/L，但固定化状态的工程菌对混合农药的降解速度与悬浮状态的工程菌相比明显减慢。表1的数据反映了固定化前后工程菌对不同农药的降解速率的变化。由表1可知，采用PVA冷冻包埋后，固定化状态的细胞的比降解速率仅为悬浮状态的细胞的20%左右，其中，对硫磷的比降解速率下降程度相对较小(约为悬浮细胞的26.8%)，而敌敌畏的比降解速率下降最大(仅为悬浮细胞的18.7%)。
有研究表明，固定化细胞比悬浮细胞有更高的比降解速率，固定化系统中酶的代谢底物范围更广，酶活性也更强[8，19～21]。然而也有研究显示，固定化细胞的比降解速率与悬浮细胞相差不大，甚至小于悬浮细胞[22，23]。LeJeune等研究聚亚氨酯泡沫共价固定磷酸三酯时，发现固定化前磷酸三酯酶对对氧磷的最大降解速率为6.29×10-2mmol/L，而固定化后，最大降解速率降低为3.29×10-2mmol/L。在本研究中，工程菌固定化后的降解速率明显降低。固定化细胞在传质过程中的底物和营养条件受限制，是比降解速率下降的主要原因。由图1的扫描电镜照片可见，固定化状态的工程菌被包裹在载体空隙内部，并聚合成团状，阻碍了营养物质的传递和底物的吸收。另外，固定化过程对工程菌细胞活性的损害也是固定化细胞活性下降的重要原因。采用多次“冷冻-解冻"的方法来制备固定化细胞，在-20℃和4℃下反复冻融，工程菌细胞不可避免地会出现死亡和OPH酶活性降低的现象，如果采用的是对低温敏感的菌株，那么菌死亡和酶失活的现象会更明显。为了减少固定化过程中微生物的死亡，在固定化时，可以加入少量盐类、糖类物质或防冻剂(如甘油、丙二醇等)，有助于固定化细胞的存活。
2.6 固定化工程菌降解混合农药的长期运行实验
为了考察固定化状态工程菌在长期使用的情况下活性变化，本研究对有机磷混合农药的降解情况进行了连续运行实验，降解时间为1h。实验结果如图7所示，固定化工程菌对对硫磷的降解率始终保持在100%，对敌敌畏、甲基对硫磷和丙溴磷的降解率下降幅度均小于15%，说明固定化状态的工程菌在50d内活性保存良好，能够满足长期连续运行的要求。另外，50d后固定化细胞结构仍保存完整，PVA凝胶基本未出现溶涨、破碎的现象，说明固定化工程菌机械强度高、稳定性较好，具有较好的实际应用价值。
综上所述，固定化状态的工程菌的降解速率比悬浮状态的工程菌大幅度下降(表1)，但经过固定化后，工程菌的稳定性较好，降解活性也能得以较长时间的保存；而且与悬浮细胞相比，工程菌细胞不易流失，因此更适宜于实际废水处理和大规模应用。另外，固定化后，单位反应体积内的细胞密度增加了，工程菌的耐毒害能力也大大增强。并且由于工程菌在缺乏选择压的条件下，其携带质粒或基因片段很容易丢失，固定化能够起到提高和保持工程菌的生物稳定性和质粒稳定性的作用。
3 结 论
(1)基因工程菌BL21能快速、高效地降解废水中高浓度有机磷混合农药，10min内，工程菌对对硫磷和甲基对硫磷的降解率高达98%，对敌敌畏和丙溴磷的降解率分别为88%和75%。但该工程菌不能降解农药马拉硫磷。
(2)有机磷混合农药废水中不同组分的降解过程需要用不同的动力学模型来描述：甲基对硫磷的降解符合底物抑制动力学方程，敌敌畏和丙溴磷的降解过程符合米-门方程，对硫磷的降解符合零级反应动力学方程。
(3)固定化后工程菌的降解速率比悬浮工程菌降低近80%，主要受底物传质过程的限制和固定化过程对细胞活性的损害的影响。
(4)在50d内，固定化工程菌活性保存良好，基本未出现溶涨、破碎现象，说明PVA包埋法具有较好的实际应用价值。
