1 材料与方法
1.1 材料蚓激酶(江中制药公司)；牛血纤维蛋白原、凝血酶、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺(TEMED，Sigma公司)；考马斯亮蓝R250(Fluka公司)；其他试剂为国产分析纯。平板电泳制胶模具、薄层聚丙烯酰胺支持膜(GelBondPAGfilm，Pharmacia公司)；扫描仪ScanMaker4(Microtek公司)。
1.2 方法
1.2.1 储存溶液配制 用磷酸缓冲液(0 1mol.L-1，pH7 4)分别配制10mg.mL-1的纤维蛋白原、10U.mL-1凝血酶和10mg.mL-1蚓激酶母液，分装后-20℃保存，临用前室温融化后按比例稀释，一般情况下1mg的纤维蛋白原需要1U凝血酶。
1.2.2 薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板的制备 参考文献方法制备薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板。在无垫片的玻璃板上加1mL水，用滚筒将聚丙烯酰胺支持膜压在玻璃板上，将带垫片(0.45mm)的玻璃板放在膜上，用夹子夹紧两块玻璃板，水平放置。将纤维蛋白原、凝血酶和缓冲液按比例混合，搅拌成无可见纤维蛋白聚集的乳白色悬浊液。再按比例依次加入丙烯酰胺、TEMED和过硫酸铵快速混匀后，缓慢地加入支持膜与带垫片的玻璃板之间。室温静置，待丙烯酰胺聚合成胶后，移开玻璃板，得到黏在膜上厚度为0.45mm均匀的聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板。为提高灵敏度与重现性，对制作胶板的丙烯酰胺和纤维蛋白原浓度进行优化选择研究。
1.2.3 丙烯酰胺和纤维蛋白原浓度优化 制作含纤维蛋白原0.5mg.mL-1和丙烯酰胺分别为5%，10%和15%的薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板，配制浓度为10，5，1，0.5，0.1，5×10-2，1×10-2，5×10-3，1×10-3，5×10-4，1×10-4，5×10-5，1×10-5，5×10-6，1×10-6mg.mL-1蚓激酶溶液，直接点样5μL，温育后用考马斯亮蓝染色，观察丙烯酰胺浓度对结果的影响。为确定纤维蛋白原浓度的影响，制作含10%的丙烯酰胺和纤维蛋白原浓度分别为0.01，0.05，0.1，0.5，1.0，1.5，2.0mg.mL-1的聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板，用几种浓度的蚓激酶溶液各5μL点样，温育后考马斯亮蓝染色。
1.2.4 加样与染色方法 将滤纸用打孔器打成直径6mm的圆形滤纸片，间隔2cm放置在胶板上，然后在滤纸上加样品，另外采取直接加样，将样品直接点在胶板上。按“1.2.2"项下制作薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板，加样后，37℃保湿温育8～12h后，用蒸馏水冲洗3～5次，分别用考马斯亮蓝或硝酸银染色观察。另制作含0.2%考马斯亮蓝的蓝色聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板，加样温育后直接脱色观察，与上述染色方法比较。
1.2.5 溶栓活性的定量分析 制作含纤维蛋白原0 5mg.mL-1和10%丙烯酰胺的薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板，取不同浓度的蚓激酶溶液点样，温育后染色，参照文献方法测量透明圈两垂直直径，以透明圈两垂直直径算术平均值平方的对数为纵坐标，以蚓激酶溶液浓度的对数为横坐标，用软件Ori gin5.0作曲线，进行回归分析，计算r值。为确定本方法所测透明圈直径算术平均值平方的对数与蚓激酶浓度对数的线性范围，分别对5×10-3～10，1×10-2～10，5×10-3～5，1×10-2～5mg.mL-14个梯度蚓激酶浓度对数及其所对应的透明圈直径平方对数回归分析，计算r值。在5块不同批次的薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板上，用1mg.mL-1的蚓激酶溶液各点样1次，测量5个透明圈两垂直直径，计算RSD值。
2 结果与讨论
2.1 胶板制备以聚丙烯酰胺代替琼脂糖作载体，使用薄层平板电泳灌胶模具，可在常温完成厚度均一的薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板的制备。胶板黏附在聚丙烯酰胺支持膜上，可以在4℃湿盒内存放1周，使用前再根据待测样品多少剪取适当大小的胶板。纤维蛋白降解情况利用考马斯亮蓝作指示剂观察，结果清晰明了，提高了检测的灵敏度。我们采用薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板法最低可观察到25ng蚓激酶产生的溶栓透明圈，而采用常规琼脂纤维蛋白平板法，最低只能观察到20μg蚓激酶产生的透明圈，薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板法比琼脂纤维蛋白平板法的灵敏度提高了近千倍。在常规的纤维蛋白平板法中，样品的蛋白含量一般不影响透明圈产生，但本方法中可能会因为样品总蛋白染色斑完全覆盖透明圈，呈现假阴性结果。本实验室曾准备用此法检测口饲蚓激酶后试验动物血液纤溶活性的变化，但因为不能排除血液蛋白的干扰而失败。如何排除样品蛋白的染色干扰是有待研究的问题。
2.2 方法优化使用含0 5mg.mL-1纤维蛋白原和不同浓度丙烯酰胺制成的胶板，测定了不同浓度蚓激酶的作用，结果显示含5%丙烯酰胺胶板上的透明圈边缘模糊，含10%和15%的边缘较清晰，而相同浓度蚓激酶产生的透明圈随着丙烯酰胺浓度增大而减小。测量并计算透明圈两垂直直径平均值结果见表1，由表1可知透明圈大小与蚓激酶浓度呈正相关。
使用不同浓度的纤维蛋白原制备胶板的结果表明，纤维蛋白原浓度在0.1～1mg.mL-1之间对透明圈的产生及观察效果影响不大。纤维蛋白原浓度低于0.1mg.mL-1时，背景着色太浅，透明圈反差小，不易观察；高于1mg.mL-1时，纤维蛋白不易完全分散，染色后胶板呈现背景染色不均匀的现象，影响观察效果，且纤维蛋白原用量大，增加了成本。根据实验结果确定0.5mg.mL-1纤维蛋白原和10%丙烯酰胺为制作薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板的适宜条件。
2.3 加样与染色方式比较直径6mm的圆形滤纸片上可加10～20μL样品，直接在胶板上加样时可加0.5～5μL样品。在胶板上直接加5μL样品时样品溶液直径在3.5mm左右。常规的琼脂纤维蛋白平板一般采用打孔加样，本胶板无法打孔，但样品量较大时用滤纸加样，样品微量时直接将样品点加在胶板上。在进行大规模溶栓活性筛选鉴定和溶栓活性的跟踪检测时，直接点加样品在胶板上，两点间隔1cm，一块5cm×10cm的胶板可点140个样品，这样既可节省样品又提高了通量。薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板经考马斯亮蓝染色后，背景呈蓝色，纤维蛋白被蚓激酶降解后在点样处形成透明圈，最低可观察到蚓激酶浓度为5×10-3mg.mL-1(即25ng蚓激酶)产生的透明圈。当蚓激酶浓度高于0.5mg.mL-1即点样处酶蛋白量大于2.5μg时，酶蛋白本身会染上色形成蓝色的加样斑，但不影响结果判定。用硝酸银染色观察时，胶板背景易呈黄色，酶蛋白本底着色清晰，纤维蛋白溶解透明圈不明显。制作含考马斯亮蓝的蓝色胶板，结果整个胶板呈蓝色，蚓激酶点样处有透明圈产生，且透明圈界限清晰，但灵敏度不高，只能观察到0.1mg.mL-1以上浓度蚓激酶所产生的透明圈。
2.4 溶栓活性的定量分析以透明圈两垂直直径的算术平均值平方的对数为纵坐标，以蚓激酶溶液浓度的对数为横坐标，用软件Origin5.0作曲线，进行回归分析，可知蚓激酶浓度在0.01～5mg.mL-1之间时成良好的线性关系，Y=0.266X+1.7778，r=0.9997。重复性试验中测得的5个透明圈两垂直直径，计算RSD=3.83%，表明薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板法重复性好，满足体外溶栓活性检测鉴定的要求。本实验建立薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板法目的是检测鉴定溶栓活性，若更换检测样品和底物，该方法也可用于其他蛋白酶活性的精确测定，并可同时用多种底物制作薄层聚丙烯酰胺胶板，根据活性不同而研究样品的底物专一性。综上所述，薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板法具有灵敏度高、精确度好、通量大、设备简单和样品用量少等优点，适用于高通量的溶栓药物筛选鉴定和溶栓产品质量控制，是一种值得推广的溶栓活性体外检测方法。
