1 材料和方法
1.1 菌种及培养
基菌种来源：取自长沙市某污水处理厂活性污泥.培养基：
(1)筛选培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，抑真菌剂15～35μg，H2O1000mL，pH7.2；
(2)发酵培养基：葡萄糖20g，KH2PO42g，K2HPO45g，(NH4)2SO40.2g，NaCl0.1g，尿素0.5g，酵母膏0.5g，MgSO4.7H2O0.2g，H2O1000mL，pH7.5～8.5.
1.2 筛选模型的建立
根据国内外有关微生物絮凝剂方面的研究报道，综合本实�榈木咛迩榭觯杓屏艘韵律秆∧Ｐ停貉凡杉∈汀患嘌�平板划线→挑菌落→纯化培养→初筛→富集培养→复筛→高效絮凝剂产生菌.
1.3 筛选方法
根据建立的筛选模型，对采集的样品按以下方法进行筛选：将菌种样品稀释(10-1、10-2、…、10-6)后涂布于筛选培养基相应的平板，选择表面光滑且带粘性的单菌落作为纯菌种.然后用接种环将各单一菌种接种到装有40ml发酵培养液的200ml三角瓶中进行预发酵培养，温度设定为30℃，摇床转速为160r/min，18～24h后，按2.5%的接种量将预发酵培养液接种到发酵培养基中进行发酵培养72h(温度和摇床转速与预发酵同).通过测定各培养液的絮凝率进行初筛，对初筛获得的菌进行平行发酵培养，将絮凝率较高且稳定性较好的菌株作为复筛菌种.
1.4 絮凝剂样品的制备
将发酵液于12000r/min离心10min，取上清液作为絮凝剂样品.
1.5 絮凝率的测定
在100mL量筒中加入80mL蒸馏水，0.4g高岭土，5mL1%的CaCl2溶液，2mL絮凝剂样品，然后加蒸馏水至100mL，调节pH至7.0，溶液倒入150mL烧杯中，放在磁力搅拌器上快速搅拌1min，慢速搅拌3min，静置3min，用吸管吸取一定深度的液层于722型分光光度计550nm处测定吸光度，以不加发酵液的吸光度为对照来确定菌发酵液的絮凝程度.
絮凝率=(A-B)/A×100%
式中，A：对照上清液550nm处的吸光度；B：样品上清液550nm处的吸光度.
1.6 菌种鉴定
菌种经多次划线分离后，经革兰氏染色，显微镜观察到的菌体形态、大小、革兰氏阴性和阳性都一致后，可确定该菌为纯菌种，之后再进行生化实验，确定其属种，参照文献和进行.
1.7 絮凝剂产生菌培养条件的优化
以通用发酵培养基为基础，分别改变培养基中的碳源、氮源种类，碳源、氮源浓度以及初始pH值和培养温度，进行发酵培养，通过絮凝率的大小比较来判断培养条件是否得到优化.
2 结果与讨论
2.1 菌种的筛选
利用去菌体培养液对高岭土悬浊液絮凝实验为指标，筛选得到具有较强絮凝能力的微生物共9株，经复筛和传代培养，获1株絮凝活性较高且稳定性较好的菌株.2.2 菌种的鉴定菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上快速生长，且兼性厌氧，最适生长温度为37℃；菌落呈米黄色，较薄，中央略为凸起，表面光滑，粘度大；镜检时该菌为短杆状，革兰氏染色为阴性，苯丙氨脱氨酶试验阴性，吲哚试验阳性，M.R试验阳性，V-P试验阴性，H2S试验阴性，不液化明胶；不可利用柠檬酸盐，但能利用多种糖类和醇类，特别是能很好地利用乳糖；同时用伊红美兰乳糖培养基培养1～2d后，菌落在透射光下呈紫色，反射光下呈现绿色金属闪光，因而初步确定其为大肠杆菌.
2.3 碳源种类对絮凝活性的影响
在培养基(KH2PO42g，K2HPO45g，(NH4)2SO40.2g，NaCl0.1g，尿素0.5g，酵母膏0.5g，MgSO4.7H2O0.2g，H2O1000mL，pH7.5～8.0)中各加入2%的不同碳源，实验结果见图1.由图1可见，该菌可以蔗糖、葡萄糖、乳糖等多种糖类及甘油、乙醇等醇类为基质产生絮凝剂，且絮凝率都达到了90%以上，而对多糖类淀粉利用不好，其絮凝率仅为64.45%.在糖类中，蔗糖的价格较为便宜；而利用醇类，如乙醇，其絮凝率可达94.92%，且用它作为碳源，可免去灭菌的操作，降低成本，容易得到，容易处理，价格低廉，是较为满意的碳源替代品.
2.4 氮源种类对絮凝活性的影响
在培养基(葡萄糖20g，KH2PO42g，K2HPO45g，NaCl0.1g，MgSO4.7H2O0.2g，H2O1000mL，pH7.5～8.0)中各加入4%的不同氮源，实验结果见图2.
由图2可见，蛋白胨、大豆粉、复合氮源是该菌产生絮凝剂的良好氮源，说明该菌对植物有机氮源的利用较好，且大豆粉为氮源更利于该菌产生絮凝剂，絮凝率达到了98.87%，在工业应用中可以大豆粉代替复合氮源，且价格便宜，易得；同时由图2也可看出，无机氮源不利于该菌生长，也不利于絮凝剂的产出，这与文献报道相一致.
2.5 碳源浓度对絮凝活性的影响
以蔗糖代替通用发酵培养基中的葡萄糖进行实验，考察了不同蔗糖浓度对絮凝活性的影响，结果如图3所示.
由图3可知，蔗糖浓度为20g/L以下时，絮凝率与蔗糖浓度成正比，当蔗糖浓度达20g/L时，其絮凝率达到最大，为97.30%.当蔗糖浓度大于20g/L时，絮凝率随碳源浓度的变化不明显，还有下降的趋势，这可能是相对过量的碳源在微生物的生长和代谢过程中产生酸化，导致溶液pH值的下降，使微生物的生长和代谢受到抑制.
2.6 氮源浓度对絮凝活性的影响
以蔗糖(浓度为20g/L)为碳源，大豆粉为氮源，分别改变大豆粉浓度，结果如图4.由图4可知，当用大豆粉做氮源且浓度在7.5～20g/L时，测出的絮凝率较为稳定，基本上在97%～99.5%之间波动，这也是实验许可的误差范围之内.同时，从实验现象可以看出，自慢搅开始即有较大的絮体产生，由于旋流作用沉淀物迅速堆积在烧杯中央，并有结块的趋势；絮凝实验终了时，被处理液的上部极为透明，而且在实验时，当絮凝剂投加量为0.1%时，絮凝率就达98.42%，由此可以看出，用大豆粉作为氮源能有效地提高絮凝活性.
2.7 培养基初始pH值对絮凝活性的影响
考察了培养基初始pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0条件下，pH对絮凝活性的影响如图5所示.
由图5可见，该菌的最适pH值为6.0～7.0，如pH=6.0时絮凝率为91.59%，pH为7.0时，絮凝率为94.27%，偏高或偏低均不利于该菌的生长和絮凝剂的合成，如pH为9.0时絮凝率仅为78.28%.2.8 培养温度对絮凝活性的影响图6显示了培养温度在25℃、30℃、35℃下的实验结果.由图6可知，该菌产絮凝剂的最佳培养温度为30℃，这与菌体最适生长温度不一致.
3 结 论
a.筛选出1株絮凝活性较高且稳定性较好的细菌菌株E-9，初步鉴定其为大肠杆菌.
b.培养条件实验表明，该菌产生絮凝剂的适宜条件为：以蔗糖、乙醇为碳源，以大豆、蛋白胨为氮源，且当蔗糖与大豆达到最佳配比时，絮凝率达99.5%，初始pH值为6.0～7.0，培养温度为30℃.
