【摘要】 目的 观察广西藤茶提取物(简称TTF)体外抗肿瘤作用。方法 采用MTT法，观察TTF及含药血清对肉瘤细胞(S180)、肝癌细胞(H22)、白血病细胞株(L1210)的细胞毒性及对细胞增殖的抑制作用。结果 TTF及其含药血清在体外对S180细胞、H22细胞和L1210细胞均有明显的抑制作用。结论 TTF体外具有抑制S180、H22、L1210肿瘤细胞增殖，且对S180细胞株的作用明显优于对H22、L1210的作用。
【关键词】 TTF；S180、H22、L1210肿瘤细胞株；体外抗肿瘤作用
Study on the anticancer effect of ampelopis grossedentata TTF in vitro
YANG Ke，ZENG Chun-hui，LI Ling-zhi.
The Department Pharmacologic Teaching and Research，Guangxi Chinese Traditional Medical College，Nanning 530001，China
【Abstract】 Objective To study the anticancer activities of TTF in vitro.Methods The anticancer effect of the TTF in vitro was studied by MTT assay，studied the toxicity and inhibition effect of the TTF to the proliferation of S180 cells，H22 cells and L1210 cells.Results S180-cells，H22-cells and L1210-cells were obviously inhibited by the TTF in vitro.Conclusion TTF had the anticancer effect on S180-cells，H22-cells and L1210-cells in vitro.
【Key words】 TTF；S180、H22、L1210 cells；anticancer effect in vitro
藤茶Ampelopis grossedentata(Hand-Mazz)W.T.Wang系葡萄科蛇葡萄属植物显齿蛇葡萄的嫩茎叶［１］。主要分布于广西、云南、广东、贵州、湖南、湖北、江西、福建等省，为瑶族民间常用的草药之一。该药相传是瑶族王――盘王遗传下来的，至今已有数百年的应用历史。其性凉，味甘、淡，具有清热解毒、消肿止痛、祛风湿、强筋骨等功效，主治黄疸型肝炎、感冒风热、咽喉肿痛、急性结膜炎等［２］。藤茶主要含黄酮类化合物，含量约45.52%［3］，其中的主要活性成分为双氢杨梅树皮素、杨梅树皮素，以双氢杨梅树皮素含量最多。现代药理研究表明藤茶总黄酮具有抗炎、保肝、降酶，抗血栓、降血糖等作用［4］，双氢杨梅树皮素对体外白血病细胞HL-60、K562、肝癌细胞Bel-7402、人鼻咽癌HK-1细胞、人乳腺癌MCF-7细胞的增殖及体内小鼠移植性B16黑色素瘤的生长均有显著的抑制作用［5，6］。以上资料提示藤茶具有良好的抗肿瘤作用，故我们对广西藤茶提取物TTF的抗肿瘤作用进行研究，现报告如下。
1 材料
1.1 细胞
肉瘤S180细胞：广西中医药研究所惠赠；肝癌H22细胞：广西民族医院惠赠；白血病细胞株L1210：广西中医学院新药开发中心惠赠。以上瘤株于动物身上以腹水形式传代保种。
1.2 动物
昆明种小白鼠(广西中医学院实验动物中心提供，合格证号：桂医动字第11004号)。
1.3 药物
TTF：由本院中药化学教研室提供，为一淡黄色粉末，纯度达85%；环磷酰胺：上海华联制药有限公司，批号：040914。
1.4 试剂
RPMI1640培养基：GIBCO公司产品，批号1243098；新生牛血清(NBS)：杭州四季青公司，批号040228；MTT：北京拜尔迪生物公司分装，Amressco 0793；二甲基亚砜(DMSO)：生工生物工程(上海)有限公司，批号54186；注射用生理盐水：四川奇力制药有限公司，批号041018。
1.5 器材
二氧化碳培养箱(美国Forma公司)；倒置相差显微镜(德国Leica公司)；酶标仪(奥地利Sunrise公司)；吉尔森微量移液器(法国Pipetman公司)；十万分之一电子天平(德国赛多利斯)；手提式消毒器(上海国营红卫医疗器械厂)。
2 方法［7］与结果
2.1 S180细胞、H22细胞、L1210细胞体外培养
分别取接种后第8天的瘤源动物，颈椎脱臼处死，用75%酒精浸泡，于超净工作台中用一次性注射器抽取1ml腹水置于4ml不含血清的RPMI1640溶液中，滴管冲吸均匀，离心(1000rpm，10min)，重复2次，最后将细胞重悬于4ml含10%新生牛血清的RPMI1640培养液中，制成细胞悬液。取5μl稀释20倍后加0.4%台盼蓝染色，计数活细胞，活细胞达95%以上。用含10%新生牛血清的RPMI1640培养液将S180细胞悬液稀释为5×１０４个/ml，H22细胞、L1210细胞悬液稀释为1×105个/ml后接种于96孔培养板，100μl/孔，平行设空白对照孔(只加培养液，不加细胞)。接种后置于37℃，5%CO２的二氧化碳培养箱中预培养24h，然后进行以下体外实验。
2.2 TTF对S180、H22、L1210细胞毒性实验(MTT法)
将药物加入已进行预培养24h的S180、H22、L1210细胞96孔培养板，共9个浓度，终浓度分别为1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μ/ml、15.63μg/ml、7.81μg/ml、3.91μg/ml，100μl/孔，每浓度3孔。平行设细胞对照孔3孔(加100μl含10%新生牛血清的RPMI1640培养液)。加药后继续培养48h，然后加入5mg/ml MTT溶液(生理盐水配制)，10μl/孔。继续培养4h。离心(2000rpm，15min)，弃去上清，加入DMSO，200μl/孔，轻轻振摇10min，以空白对照孔调零，在550nm波长处用酶标仪测定OD值。按Reed-Muench法计算IC５０、ＴＣ５０、ＳＩ，结果见表1、2、3。表1 TTF对S180细胞的体外毒性实验 (略)表2 TTF对H22细胞的体外毒性实验 (略)表3 TTF对L1210细胞的体外毒性实验 (略)
结果显示，TTF对S180细胞体外有一定的细胞毒性，其中TC50为741.9μg/ml，IC50为20.02μg/ml，SI为37.1。TTF对H22细胞体外有一定的细胞毒性，其TC50为119.45μg/ml，IC50为36.83μg/ml，SI为3.24。TTF对L1210细胞体外有一定的细胞毒性，其TC50为125.28μg/ml，IC50为47.36μg/ml，SI为2.65。
2.3 TTF对S180、H22、L1210细胞体外增殖的抑制作用
细胞培养同上，将药物加入已进行体外预培养24h的S180细胞96孔培养板，100μl/孔，每浓度5孔，共9个浓度，终浓度分别为70μg/ml、50μg/ml、35.7μg/ml、25.5μg/ml、18.22μg/ml、13.0μg/ml、9.3μg/ml、6.64μg/ml、4.74μg/ml。同时做细胞对照孔(加细胞和培养液，不加药物)。加药后继续培养48h，倒置显微镜下观察细胞生长状况，然后加入5mg/ml MTT溶液，10μl/孔。继续培养4h，离心(2000rpm，15min)，弃去上清，加入DMSO，200μl/孔，轻轻振摇10min，以空白对照孔调零，在550nm波长处用酶标仪测定OD值。按以下公式计算细胞抑制率，并以药物浓度的对数和抑制率作回归方程，计算IC50。结果见表4、5、6。表4 TTF对S180细胞的体外抑制作用 (略)表5 TTF对H22细胞的体外抑制作用 (略)表6 TTF对L1210细胞的体外抑制作用 (略)
细胞抑制率%=(1-药物组OD值均数/细胞对照组OD值均数)×１００
结果显示：TTF在无毒浓度下对S180细胞体外增殖有良好的抑制作用，其IC50为15.69μg/ml；对H22细胞体外增殖有一定的抑制作用，其IC50为36.57μg/ml；对L1210细胞体外增殖有一定的抑制作用，其IC50为45.16μg/ml。
3 讨论
恶性肿瘤是一种严重疾病，治疗难度极大，且其发病率一直呈上升趋势，据世界卫生组织预测，至2020年随世界人口达80亿，将有2000万新发癌症病例，其中死亡人数将达1200万，而其中大部分将发生在发展中国家［8］。目前的治疗手段以手术、放疗、化疗为主，手术多适用于早期癌瘤患者，放疗、化疗只对敏感瘤种有效，但同时又会出现严重的毒副反应和后遗症，甚至造成严重的医源性疾病而危及生命，因此中草药的抗癌作用越来越受到重视。
藤茶是民间常用的草药，到目前为止未见其毒性报道。从藤茶主要活性成分双氢杨梅树皮素良好抗肿瘤作用的资料报道［5，6］，推测藤茶提取物TTF具有抗肿瘤作用。但目前对TTF抗肿瘤作用的研究报道甚少，为此，我们研究TTF体外对S180肉瘤，H22腹水型肿瘤及L1210白血病瘤株抗肿瘤作用。实验观察结果显示：体外毒性作用证明，TTF在一定浓度下对三个瘤株都有直接的杀伤作用；在无毒浓度下体外实验结果显示，TTF对S180细胞、H22细胞、L1210细胞均有抑制作用，对S180细胞的抑制作用为明显，IC50＜2μg/ml。对其含药血清和体内抗肿瘤作用及其作用机制有待进一步研究。
【参考文献】
1 中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴，第2册.补编.北京：科学出版社，1983，349-356.
2 全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编(下册).北京：人民卫生出版社，1986，300.
3 周桂霞，何群，裴刚，等.瑶族藤茶中总黄酮类成分的含量测定.湖南中医药学报，1999，5(12)：30-31.
4 钟正贤，陈学芬，周桂芬，等.广西产藤茶总黄酮的药理研究.广西科学，1999，6(3)：216.
5 周宁宁，朱孝锋，谢冰芬，等.无刺根中蛇葡萄素体外抗肿瘤作用研究.广东药学，2000，10(4)：7-8.
6 刘德育，罗曼，谢冰芬，等.蛇葡萄素的抗肿瘤作用研究.癌症，2001，20(1)：1372-1375.
7 徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学.第三版.北京：人民卫生出版社，2005，1784.
8 Eaton L.World cancer rates set to double by 2020.BMJ，2003，326：728.
